FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeine Vorgehensweise für das Einfügen von FSL-Konstrukte (Abbildung 1) in biologischen Membranen. Der Einfachheit halber wird das Protokoll nur auf Zellen (kodecytes), die bei einer Konzentration von 100% verweisen. Allerdings ist der Begriff Zellen austauschbar mit Virionen (kodevirions) oder Organismen oder zellulärer Strukturen und deren Konzentration in Verdünnungsmittel ist nicht wichtig, vorausgesetzt, es ist immer zwischen den Tests, Kontrollen und Untersuchungen im Einklang. Mit roten Blutkörperchen des Hämatokrits wird in der Regel 80%, aber mit Virionen, Embryonen und anderen Zellen ist es in der Regel weniger als 1%. Die Methode ist sehr robust und wird modifizierten Membranen erzeugen, wenn sie von einer ihrer Varianten verwendet, sondern Verfeinerung erforderlich zu optimieren und zu standardisieren, den Grad der Veränderung für bestimmte Anwendungen benötigt werden. 1. Vorbereitung der FSL-Konstrukten Zur Vorbereitung der FSL konstruieren Lager Lösung zunächst Rekonstitution des trockenen FSL Produkt (Tabelle 1) durch die Zugabe von 1,0 ml Verdünnungsmittel (oder wie in der Packungsbeilage angegeben), um ein Produkt Durchstechflasche. Kurz beschallen (30 Sekunden). Dies wird einen 1mg/ml Lösung, die in 100 ul sterilen Behältern aliquotiert und gelagert werden kann bei 2-8 ° C bis zu einer Woche, oder gefroren für bis zu 3 Monaten. Zur Vorbereitung arbeiten FSL konstruieren Lösungen für die Insertion, unmittelbar vor der Verwendung kurz beschallen (30 Sekunden) der Stammlösung keine Mizellen zu homogenisieren. Verdünnen Sie die FSL-Konstrukt in Puffer (vorzugsweise nicht mit Lipiden oder stark hydrophoben Material), um die Konzentration oder über einen Bereich erforderlich, falls gewünscht. Notes: FSL-Konstrukte werden in der Regel in Zellen einfügen in Lipid-haltigen Medien, sondern wird in der Regel so viel wie ein 50X höher FSL arbeitet Konzentrationen, als wenn in PBS oder andere Lipid-freien Medien erfordern. Der Arbeitsbereich Verdünnungen wird über den Antrag, das Nachweisverfahren Sensibilität, die Art der FSL zu konstruieren, und der Grad der Modifikation erforderlich abhängen. Typischerweise ist das Spektrum der Verdünnung wird zwischen 10-500 pg FSL pro ml Verdünnungsmittel für den Kohlenhydrat-FSL-Konstrukte und 1-100 ug / mL für andere FSL Konstrukte wie Fluorophore und Biotin werden. Wenn der Vorbereitung Einsetzen Verdünnungsmittel mit mehreren FSL konstruieren, fügen Sie einfach die Konstrukte gemeinsam in die gleiche Verdünnungsmittel bei ihrer normalen Arbeitszeit Konzentration. Wenn ein Konstrukt ist, bei viel höherer Konzentration als andere, können einige Anpassungen (Erhöhung) der Konzentration für das kleinere Bau benötigt werden. Alternativ Konstrukte können nacheinander zugegeben werden, vorzugsweise mit der höchsten Konzentration erste Konstrukt, gefolgt von den kleineren. FSL konstruieren Konzentrationen oberhalb von 1000 pg / mL können erhebliche Mengen an Lipid in einer Zellmembran einzuführen, und kann die Form der Zelle zu ändern oder machen es anfälliger für Lyse. FSL bauen funktionierende Lösungen sollten bei 2-8 ° C gelagert werden und innerhalb von wenigen Tagen. FSL-Konstrukte können in Wasser verdünnt werden, sondern reduziert die Stabilität haben und muss innerhalb von Stunden verwendet werden. Wenn Sie die Packungsbeilage gibt Wasser als Verdünnungsmittel Rekonstitution des Produktes in die Durchstechflasche enthält auch Salze (wie in der Packungsbeilage angegeben). 2. Insertion von FSL Construct (s) in Membranen Waschen Sie zuerst die Zellen für FSL Modifikation frei von ungebundenen Lipide durch Zentrifugation und mit PBS-oder Lipid-freie Zelle Medien als Waschlösung. Packen Sie die Zellen oder die Aussetzung in 100 ul Verdünnungsmittel. Gleichzeitig bereiten Kontrollen, die im Idealfall sowohl unveränderte Zellen (Inkubation mit PBS anstatt FSL-Lösung) und / oder Zellen mit einer gutartigen, aber miteinander verbundene FSL konstruieren geändert werden sollte. Geben Sie 100 ul einer geeigneten Verdünnung des FSL-Lösung (mit 1 oder mehr FSL Konstrukte) zu den Zellen und Inkubation für 1-2 Stunden bei 37 ° C. Ein ähnliches Ergebnis kann durch 6 Stunden Inkubation bei 25 ° C erreicht werden oder über Nacht (18 Stunden) bei 4 ° C – Mischen ist alle paar Stunden zu empfehlen, wenn schwere Zellsuspensionen verwendet werden. Wash (optional) zweimal mit PBS oder Medium mit einem freien FSL Konstrukte zu entfernen und bereiten eine entsprechende Suspension. Notes: Das Verdünnungsmittel verwendet werden, um die Zellen aussetzen kann Zellkulturmedien, PBS, Zell-Storage-Lösungen, etc, aber möglichst ohne Fett (zB fötales Kälberserum) oder Detergenzien (zB Tween). Unterschiedliche Volumina (100 mL) Verhältnisse (als 1:1-Zellen / FSL-Lösung) oder Inkubation Bedingungen von Zeit und Temperatur kann verwendet werden, sofern im gleichen Verhältnis, Konzentration und Volumen werden verwendet, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. 3. Handhabung und Visualisierung Sobald die FSL Änderung abgeschlossen ist die kodecytes können bei 4-8 ° C in Lipid-freien Medien gespeichert oder genutzt werden. Kodecytes und kodevirions der Regel verhalten sich genauso wie unveränderten Zellen / Virionen und kann Handled und betrachtet unter normalen Testsysteme (Mikroskopie, Serologie, Durchflusszytometrie, etc). Sie haben meist keine besonderen Anforderungen außer für die Vermeidung von Lösungsmitteln / Detergenzien / Lipide, dass die Lipid-Konstrukte aus Membranen eluieren kann. Notes: Konstruiert wird in der Membran von inaktiven Zellen, wie rote Blutkörperchen bleiben, wenn in Lipid-freien Medien für das Leben der Zelle gespeichert ist. In Zellen mit aktiver Membranen der Konstrukte wird internalisiert und abgebaut werden, mit einer Rate abhängig Zellmembran Aktivität. Tote Zellen werden in der Regel einen hohen Gehalt an FSL Konstrukte, dies kann verwendet werden, um lebensfähig Zellen von lebenden Zellen zu trennen. Wenn kodecytes gespeichert sind (oder in vivo) in Lipid-haltigen Medien / Umgebungen, wie zB Serum / Plasma des Konstrukts wird langsam aus der Membran eluiert über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, je nach Temperatur-und Lipid-Konzentrationen / Kompositionen. 4. Repräsentative Ergebnisse: Die folgende repräsentative Ergebnisse sind abhängig von der Konstruktion verwendet werden (Tabelle 1), seine eingefügt Konzentration und die relative Sensitivität und Spezifität des Nachweises System (s). Im Allgemeinen sind alle FSL Konstrukte in die Zellen nach 1 Stunde einlegen, aber die optimalen Bedingungen müssen für jede Situation geschaffen werden. FSL-Konstrukte können verwendet werden, um die Außenseite der eine Vielzahl von lebenden Zellen 3-9,11,14 Label sein. In den Beispielen in Abbildung 2 dargestellten Embryonen in verschiedenen Stadien verwendet wurden (da sie eine fragile Zelle sind), aber auch andere Zellen (Abbildung 3) oder umhüllt Virionen (Abbildung 4) können auch gekennzeichnet werden. FSL-Fluorescein ermöglicht die direkte Markierung von Oberflächen (Abbildungen 2-4), während FSL-Biotin und anderen FSL Konstrukte die Verwendung eines sekundären Detection System (in der Regel Avidin / Antikörper / Lektine) erfordern, um ihre Anwesenheit (Abb. 5) zeigen . Blutgruppe Marker für die menschliche oder tierische Spezifität können Zellen, einschließlich Erythrozyten 4-9 (Abbildung 6) angebracht werden. Da die Höhe der FSL auf einem kodecyte Konstrukt ist kontrollierbar und reproduzierbar 4-6, können kodecytes für die Antikörper-Quantifizierung vorgenommen (Tabelle 2 und Abbildung 6). Die eigentliche Quelle der Zellen ist nicht wichtig, können sie alle Arten oder sogar von den gleichen Ursprung wie die Quelle des Antikörpers, wodurch eine auf dem nur unvereinbar Antigen ist, dass durch die FSL 7,8 (Abbildung 6) eingeführt. Tabelle 2. Repräsentativen serologischen Reaktionen von drei verschiedenen FSL-A (tri) red cell kodecytes gegen Verdünnungen von monoklonalen anti-A getestet. Die 50 uM Lösung von FSL-A (tri), wenn mit dem gleichen Volumen der Gruppe O Erythrozyten inkubiert produziert starke A-Antigen-positiven Zellen, die durch eine 1:512 Verdünnung des monoklonalen anti-A nachgewiesen werden konnte. Die 5 – und 10-fach niedriger FSL-A (tri)-Lösungen produziert kodecytes mit weniger Blutgruppe A-Antigen-Expression. Abbildung 1. FSL konstruieren Überblick. Wie eine Blume FSL Konstrukte besteht aus drei Hauptkomponenten. Die funktionalen Kopf (F) im Fall des FSL-Konstrukt kann eine Vielzahl von verschiedenen biologisch funktionellen Gruppen, einen Abstandshalter (S) entwickelt, um Abstand von F von der Membran zu induzieren, zu verbessern Wasserdispergierbarkeit und nicht-reaktiv mit Serum werden, während die Diacyl Lipid ermöglicht das Konstrukt spontan in Oberflächen zu integrieren. (I) FSL-GB3 mit einer Blutgruppe Gb 3 (oder P k) Trisaccharid Epitop Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A (tri) mit einer Blutgruppe A Trisaccharid Epitop GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-Fluorescein. (IV) FSL-Biotin mit einem Biotin-F-Gruppe. Die funktionelle Gruppe von Strukturen in I-III sind konjugiert zu einer aktivierten adipat Derivat Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), während die spacer der Struktur IV ist carboxymethylglycine-adipat basiert. Abbildung 2. FSL-Fluorescein markierter muriner Embryonen. Alle Bilder von Live-Embryonen, die beschriftet, wenn ihre Zona pellucida (ZP) war intakt (dh der FSL-Konstrukt durch die ZP auf den Embryo innerhalb label bestanden) waren. Bilder I-IV sind der ZP-freien Embryonen aus ihrer ZP mit Säure Tyrodes post Markierung mit FSL-Fluorescein freigesetzt. Identische Färbung geschieht unabhängig davon, ob Embryonen wurden FSL mit ZP intakt oder ZP frei modifiziert. Die Embryonen werden direkt mit FSL-Fluorescein markiert, durch die 2 Stunden 37 ° C-Methode in serumfreien Zellkulturmedien, gewaschen und dann betrachtet unter Fluoreszenz-Mikroskopie. (I) ZP freien Zwei-Zell-Maus-Embryo, zeigt auch klassische intensive Polkörper Färbung. (II-III) ZP freien Vier-Zellen-und acht Zellen murine Embryonen, die beide zeigen schattenhafte Färbung der Zellen, die outs sindide dem Mikroskop Ebene konzentrieren. (IV) ZP free 16 Zelle murinen Embryo. (V) ZP intakte murine Blastozysten Embryonen (d4-d5), wo beide den Embryo und zona gekennzeichnet sind. Abbildung 3. FSL-Fluorescein und Zebrafisch 14. (I) Microangiography auf einem 52 HPF (Stunden nach der Befruchtung) Zebrafischlarven direkt in den Kreislauf mit FSL-Fluorescein injiziert. Der Zebrafisch Gefäßsystem ist gefärbt. (II) FSL-Fluorescein heterogenen Zebrafisch Nierengewebe Zellen (ZK kodecytes) wurden ex vivo erzeugt dann in den Kreislauf eines 52 hpf Empfänger Zebrafisch Mikro-Injektion. In-vivo-Beobachtungen des ZK kodecytes wurden 2 Stunden nach der Injektion durch die Abbildung der Gefäßsystem unter Fluoreszenz mit Zeitraffer-Mikroskopie. Gezeigt wird ein einzelnes Videobild mit großen langsamen oder unbewegliche Zellen (angegeben mit orange Pfeile) und schnelllebigen Zellen (verschwommene Bilder durch Bewegung – angezeigt durch grüne Pfeile). Labeling ermöglicht Echtzeit in vivo Beobachtung des Verhaltens und Bioverteilung des ZK kodecytes. (III) Die orale Aufnahme von FSL-Fluorescein erreicht durch Eintauchen Zebrafischembryonen in FSL-Fluorescein mit Medien für bis zu 5 Tage. Gewaschen wurde durch die Übertragung von Embryonen in die Medien, die keine FSL-Konstrukte (mindestens 6 Stunden erforderlich ist, kann aber für mehrere Tage) erreicht. (IIIa) Hellfeld-Mikroskopie der FSL-Fluorescein behandelt Zebrafisch entsprechend der angrenzenden Fluoreszenzbild (IIIb). Die Fluoreszenz wurde bevorzugt im Darm befindet. Keine Färbung wurde in unbehandelten Kontrolle Embryonen (IVa und IVb) beobachtet. Abbildung 4. FSL-Fluorescein Kennzeichnung von Virionen 10 VSV und H1N1. (I) vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) wurde direkt mit 10 pg / ml FSL-Fluorescein für 2 h bei 37 ° C gekennzeichnet, gefolgt von Fixieren mit 4% Paraformaldehyd und dann Durchflusszytometrie. Keine Reinigung des VSV kodevirion post FSL Kennzeichnung erforderlich war. (II) Die Durchflusszytometrie von Schweinen Hodenzellen mit menschlichen A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) infiziert kodevirions beschriftet mit FSL-Fluorescein. Nicht infizierte Zellen werden als die schwarze Linie zu sehen, während Fusion der H1N1 kodevirion mit dem ST-Zellen führt zu einem fluoreszierenden Zellen (rote Linie). Abbildung 5. FSL-Biotin-markierter Zellen und die anschließende Visualisierung über Avidin 7,8. Alle Zellen wurden zunächst mit FSL-Biotin für 1 h bei 37 ° C gekennzeichnet, gewaschen und dann mit Fluorophor markierten Avidin, gewaschen und nass für die Fluoreszenzmikroskopie montiert reagiert. (I) konfokale Abbildung eines murinen Embryo Blastozyste Zusammengestellt. (II) Central konfokalen Scheibe des Embryos aus dem vorhergehenden Bild. (III) Live beweglichen menschlichen Spermien – Unschärfe tritt als Folge ihrer Bewegung. (IV) Feste (4% Paraformaldehyd nach der Insertion) menschlichen Spermien. (V) Human Erythrozyten. (VI) Feste (4% Paraformaldehyd pre-Insertion) RL95 Endometrium menschlichen Karzinom. (VII) Unfixierte RL95 Endometrium menschlichen Zelllinie. (VIII) Biotin RBC kodecytes beobachtet in eine Blutprobe entnommen 2 Stunden nach der intravenösen Infusion von kodecytes mit (VIIIa), was einem Feld unter dem Lichtmikroskop while (VIIIb) ist das gleiche Feld unter Fluoreszenz angesehen, die Identifizierung der beiden kodecytes in das Feld -of-view. Berechnung des Verhältnisses der kodecytes zu unmarkierten Zellen verwenden können als ein Indikator für das Überleben. (IX) Live menschlichen Endometrium Biotin kodecytes visualisiert durch die Bindung an avidinylated Perlen. Abbildung 6. FSL-Kohlenhydrat der Blutgruppe Marker für serologische Profiling hinzuzufügen. (I) Human red cell Galili kodecytes wurden mit einer Reihe Konzentration von FSL-Galili (500 ug / mL) erstellt und getestet gegen Verdünnungen von humanem Serum. Menschliche rote Blutkörperchen nicht auf natürlichem Wege mit dem xenoantigen Galili Antigen auftreten. Solche kodecytes können quantitative Antikörperspiegel im Serum verwendet werden. In diesem Beispiel ist der Spender war entschlossen, eine Anti-Galili Titer von 1:32 haben. (II) Durch die Schaffung kodecytes mit Verminderung der Zahl der FSL ("Antigen-Titer"), eine optimale Antigen Ebene Antikörper erkennen bestimmt werden kann (in diesem Beispiel Le a) sein. Die Zellen können erstellt, um nur ein positives Ergebnis, wenn der Antikörper bei Überschreiten einer bestimmten Titer werden. Die Höhe der FSL-Antigen erforderlich, um ein positives Ergebnis geben, hängt von der Qualität und das Niveau der Antikörper erkannt wird. Für Kohlenhydrat-Antigene, wird ein FSL Lösung von 100 ug / ml in der Regel in einer starken positiven Reaktion führen. (III) Human Gruppe O roten Zellen wurden modifiziert, um ein bestimmtes Niveau der A ant habenigen (standardisierte A kodecytes) und verwendet werden, um präzise und reproduzierbar quantifizieren anti-A in humanem Serum. In diesem Beispiel ist die Anti-A-Titer in der Gruppe O-Serum getestet wird 1:32 und die kodecytes wurden vom Spender der eigenen roten Blutkörperchen vorbereitet. (IV) Blutgruppe A und B-Antigene gleichzeitig in einer einzigen Gruppe O red cell Probe eingefügt werden verwendet, um ein schwaches B schwach kodecytes erstellen. Diese kodecytes kann für ABO Qualitätskontrolle verwendet werden. Dieses Ergebnis zeigt die Analyse einer speziell formulierten Ein schwaches B schwach kodecyte gegen Anti-A und Anti-B-Reagenzien getestet und gibt erwarteten schwachen Reaktionen.