Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em> Anopheles</em> Spp.
Summary
Una forma rápida y asequible para extraer parásito calidad malaria y ADN del vector a partir de muestras de mosquitos se describe. Capitalizando en las propiedades quelantes de resina Chelex, el simple método permite el genotipado de parásitos de la malaria en mosquitos fases glándula del intestino medio y salivales, así como la identificación molecular de los<em> Anopheles</em> Entre hermanos especies por PCR.
Abstract
Los países endémicos están adoptando cada vez más herramientas moleculares para la tipificación eficiente, identificación y vigilancia contra parásitos de la malaria y los mosquitos vectores, como parte integral de sus programas de control de 1,2,3,4,5. Para el establecimiento sostenible de estos enfoques precisos en las operaciones de investigación para fortalecer el control de la malaria y los esfuerzos de eliminación, métodos sencillos y asequibles, con el reactivo parsimonioso y requerimientos de equipo son esenciales 6,7,8. Aquí les presentamos una sencilla técnica basada en Chelex para la extracción de parásito de la malaria y el ADN vector de muestras de campo mosquitos recolectados.
Hemos identificado morfológicamente 72 Anopheles gambiae sl. Desde 156 mosquitos capturados por piretro spray de capturas en los dormitorios de los hogares dentro de 2.000 km 2 cerca del Instituto de Malaria en Macha. Después de la disección para separar la cabeza y el tórax del abdomen para todos los gam 72 AnophelesBIAE sl. mosquitos, las dos secciones se colocaron individualmente en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se sumergieron en 20 l de agua desionizada. Utilizando una punta de pipeta estéril, cada sección de mosquito se homogeneizó por separado a una suspensión uniforme en el agua desionizada. Del homogeneizado resultante de cada sección de mosquito, 10 l se retuvo mientras que el otro 10 l se transfirió a un tubo esterilizado en autoclave por separado 1,5 ml. Las alícuotas separadas se sometieron a extracción de ADN ya sea por el Chelex simplificado estándar o la salazón a cabo la extracción protocolo de 9,10. El protocolo de salificación es llamado y utilizado ampliamente debido a que emplea altas concentraciones de sal en lugar de disolventes orgánicos peligrosos (tales como fenol y cloroformo) para la etapa de precipitación de la proteína durante la extracción de ADN 9.
Los extractos fueron utilizados como plantillas para la amplificación por PCR usando cebadores dirigidos artrópodo deshidrogenasa mitocondrial nicotinamida adenina dinucleótidonase (NADH) subunidad gen 4 (ND4) para comprobar la calidad del ADN 11, una PCR para la identificación de las especies de Anopheles gambiae hermanos de 10 y una PCR anidada para la tipificación de infección por Plasmodium falciparum 12. La comparación con la calidad del ADN (ND4) PCR mostró 93% de sensibilidad y 82% especificidad para el enfoque Chelex en relación con lo establecido desalado protocolo. Los valores correspondientes de sensibilidad y especificidad fueron del 100% y 78%, respectivamente, utilizando hermano de identificación de especies PCR y 92% y 80%, respectivamente, para P. falciparum detección por PCR. No hubo diferencias significativas en la proporción de muestras en las que la señal de amplicón con el Chelex o el desplazamiento salino normal protocolo en las tres aplicaciones de la PCR. El enfoque Chelex requiere tres reactivos simples y 37 min en completarse, mientras que el. Desalado protocolo implicó 10 diferentes reactivos y 2 h 47 min y el tiempo de «tratamiento, incluyendo una etapa durante la noche Nuestros resultados muestran then el método de Chelex es comparable a la existente salazón a cabo la extracción y pueden estar sustituidos como un enfoque sencillo y sostenible en entornos con recursos limitados donde una cadena de suministro constante reactivo a menudo es difícil de mantener.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de Chelex simplificada presentada aquí permite la extracción de la calidad Anopheles spp y P. falciparum ADN de las muestras de mosquitos susceptibles de diversas aplicaciones de la PCR. Esta técnica se puede emplear para la identificación molecular de los mosquitos vectores de la malaria y la vigilancia de resistente a los medicamentos P. alelos falciparum en los mosquitos para los programas nacionales de control de la malaria. Las ventajas de la técnica de Chelex simplificado incluyen la simplicidad, menos reactivos y, por tanto costo, seguridad y tiempo de procesamiento más corto (37 min) que los protocolos estándar tales como el método de precipitación salina 10 (2 hr 47 min y una etapa durante la noche, Tabla 1). Las ventajas antes mencionadas y los requisitos mínimos de reactivo (3 reactivos) en comparación con el actual protocolo estándar (10 reactivos, Tabla 1) 11,15, que el protocolo Chelex simplificado particularmente amigable para los laboratorios del país endémicas donde un reactivo constantecadena de suministro es a menudo difícil de mantener. Una limitación de este método es que como el protocolo estándar, que fue también objeto de inhibidores de la PCR sabe que se producen en el integumento mosquito 16. Sin embargo, esto es fácilmente aliviado por la inclusión de BSA en los ensayos. BSA también se ha empleado con éxito como un potenciador de la amplificación en contra de inhibidores en otras aplicaciones de la PCR 17,18.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están en deuda con los jefes, jefes y comunidades de Macha para su unwaveing cooperar durante los mosquitos colecciones de campo de muestra. Dr. Doug Kent Norris y Rebeca ofreció invaluable experiencia en el protocolo de desalado. Este trabajo fue financiado por la Universidad Johns Hopkins Malaria Research Institute sistema piloto de subvención. Mosquitos y parásitos patrones de ADN de laboratorio fueron donados amablemente por MR4, American Type Culture Collection y.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
Referenzen
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N’Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
