Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em> Anopheles</em> Spp.

Exemplos de resultados de ensaios de PCR para a qualidade do extracto mosquito DNA (Figura 1), Anopheles arabiensis identificação molecular (Figura 2) e P. falciparum de detecção (Figura 3) mostra que o método de Chelex simplificada dá resultados semelhantes ao padrão de salting out protocolo 10, apesar de muito menos passos (Tabela 1). Com uma qualidade comparável DNA nos respectivos extractos, não é surpreendente que a taxas de positividade de amostra em relação a um. espécies crípticas gambiae, bem como as taxas de infecção do parasita não foram estatisticamente diferentes com base no teste de McNemar qui-quadrado (Figura 3). Sensibilidade (%) foi calculada como TP / (TP + FN) * 100, onde TP denota verdadeiros positivos e falsos negativos FN indica. Especificidade (%) foi determinada como TN / (TN + FP) * 100, onde TN indica verdadeiros negativos e FP denota falsos positivos. A qualidade do ADN (ND4) PCR mostrou sensibilidade de 93% e especificidade de 82% para a abordagem Chelex em comparação com o padrão estabelecido ouro salting out protocolo como. Os correspondentes valores de sensibilidade e especificidade foram de 100% e 78%, respectivamente, utilizando-se a identificação da espécie irmão PCR e 92% e 80%, respectivamente, para P. falciparum detecção PCR. A adição de BSA para misturas de reacção resultou em um aumento geral de positivos de PCR (Figura 3), devido ao alívio da PCR inibidores 14, tanto para o Chelex simplificada e regular salting out protocolo. No entanto, este aumento não foi estatisticamente significativa, exceto para a qualidade do DNA (ND4 PCR) em extratos Chelex (p = 0,039). Específica de alelo de digestão com enzimas de restrição em P. falciparum DHFR (ou outro gene alvo) amplicon permite a genotipagem de infecções da glândula do intestino médio e salivares malária para os alelos de resistência da droga (Figura 4, os dados de glândulas salivares não mostrado). <table border = "1"> Procedimento simples Chelex Padrão Salga fora Procedimento Passos Reagentes Passos Reagentes Adicionar espécime a 1,5 ml tubo de microcentrífuga e homogeneizar em 100 ul de PBS 1X / Saponina solução a 1% (2 min). Deixar a temperatura ambiente durante 20 min. Centrifugação a 20000 xg durante 2 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 100 ul de PBS 1X e misture delicadamente por momentaneamente vórtex (3 seg.) Centrifugação a 20000 xg durante 2 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 25 ul de 20% de Chelex w / v em água desionizada e 75 uL de água estéril desionizada. Pierce buraco na tampa do tubo de amostra usando quente, agulha hipodérmica estéril 23G e conteúdo do tubo ferva por 10 min. Girar o tubo de microcentrífuga de 20000 xg durante 1 min. Transferir o sobrenadante para frasco prelabeled estéril e solução de ADN armazenar a -20 ° C até à sua utilização (2,5 ul de reacção de PCR de 25 uL). PBS Saponina Chelex-100 esferas Adicionar espécime a 1,5 ml tubo de microcentrífuga e homogeneizar em 100 ul de tampão * Bender com DEPC a 1% (2 min). Incubar a 65 ° C durante 1 h. Adicionar 15 ul de acetato de potássio a frio 8 M. Misturar suavemente e incubar em gelo durante 45 min. Centrifugue a amostra em tubos de microcentrífuga a 20000 xg durante 10 min e de transferência de sobrenadante para um tubo novo ml 1.5. Adicionar 250 ul de etanol a 100% e misturar bem invertendo o tubo. Incubar amostra à temperatura ambiente durante 5 min. Girar as amostras a 20.000 xg durante 15 min. Aspirar e descartar o sobrenadante, deixando o sedimento secar completamente no tubo (30 min). Ressuspender o granulado em 20 ul de 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) durante a noite a 4 ° C. Adicionar 80 ul de água tratada com DEPC e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. Dietilpirocarbonato (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M de NaCl Sacarose 0,2 M 0,1 M de Tris-HCL 0,05 M de EDTA, pH 9,1 SDS a 0,5% em água DEPC 8 de acetato de potássio M Etanol 0,1 X salina tampão de citrato de sódio (SSC) RNAse (10 ug / ml) Tempo total: 37 min Tempo total: 2 horas 47 min, mais durante a noite Tabela 1. Passo a passo de comparação dos reagentes e requisitos de tempo para a Chelex protocolo simples e ficarard salting out método de extração de DNA a partir de amostras de mosquitos. Figura 1. ND4 mitocondrial comparação PCR de DNA de qualidade simplificada Chelex "C" e padrão salting out "M" extractos de amostras de campo Anopheles arabiensis. NC, controlo negativo; M1 e C1, C2 e M2, M3 e C3, e C4 e M4 são emparelhados salting out e extractos a partir de uma mesma Chelex. espécimes do mosquito arabiensis. L, 100 bp ADN. Figura 2 molecular de PCR para identificação arabiensis Anopheles C1 e M1, M2 e C2, C3 e M3, M4 e C4 denotam amplicon respectiva de salting out "M" e simplificado Chelex "C" extratos de DNA para amostras de mosquitos mesmos;.. AR, Anopheles arabiensiscontrole positivo; L, 100 bp ADN. Figura 3. Detecção de positivos sobre Chelex e salga fora extratos de DNA de amostras de campo do mosquito, com ensaios de PCR para a identificação molecular de Anopheles arabiensis (AR) 10, artrópode gene NADH desidrogenase 4 (ND4) teste de DNA de qualidade 11 e P resistência antifolato droga . falciparum DHFR genotipagem 12 (F-M4). Os resultados apresentados para os testes realizados com ou sem BSA na mistura de reacção. O teste de McNemar de qui-quadrado foi usado para determinar se as diferenças entre cento dos PCRs positivas de DNA extraído a partir da Chelex simplificada e o padrão de salting out protocolos foram estatisticamente significativas. <strong> Figura 4. Aplicação da simplificado Chelex protocolo em genotipagem P. falciparum em mosquitos (meados de intestino dados mostrados) para os alelos de resistência a drogas. BstN I em digestão amplicon flanqueando codão 108 do P. falciparum gene DHFR 12 mostra os mutantes resistentes cicloguanilo S108T em amostras de mosquitos (M1-M5; mid-intestinal dados apresentados). U, 522 pb digerido amplicon; FCR3, padrão de laboratório P. falciparum clone controle positivo levando S108T; K1, P. falciparum laboratório padrão de controle clone contábil negativo cicloguanilo sensível S108N, L, 100 bp ADN.