Un protocole Chelex simple pour l'extraction d'ADN à partir de<em> Anopheles</em> Spp.
Summary
Un moyen rapide et abordable pour extraire le parasite du paludisme et de la qualité de l'ADN du vecteur à partir d'échantillons de moustiques est décrite. Capitalisant sur les propriétés de chélation de résine Chelex, la méthode simple permet le génotypage des parasites du paludisme dans les phases de moustiques glandes de l'intestin moyen et salivaires, ainsi que l'identification moléculaire de l'<em> Anopheles</em> Fratrie espèces par PCR.
Abstract
Les pays d'endémie sont de plus en plus l'adoption d'outils moléculaires pour le typage efficace, l'identification et la surveillance contre les parasites du paludisme et les moustiques vecteurs, en tant que partie intégrante de leurs programmes de lutte 1,2,3,4,5. Pour l'établissement durable de ces approches précises dans les opérations de recherche afin de renforcer la lutte antipaludique et les efforts d'élimination, les méthodes simples et abordables, avec le réactif parcimonieux et les besoins en équipement sont essentiels 6,7,8. Nous présentons ici un simple Chelex technique basée sur l'extraction de l'ADN du parasite du paludisme et de vecteur à partir d'échantillons prélevés sur le terrain de moustiques.
Nous morphologiquement identifié 72 Anopheles gambiae sl. De 156 moustiques capturés par pyrèthre bombe insecticide dans les cabines de ménages dans une 2,000 km 2 à proximité de l'Institut du paludisme à Macha. Après dissection de séparer la tête et le thorax de l'abdomen pour tous les gam 72 Anophelesgambiae sl. moustiques, les deux parties ont été placés individuellement dans des tubes de 1,5 ml microtubes et immergé dans 20 ul d'eau déminéralisée. Utiliser un embout de pipette stérile, chaque section séparément moustique a été homogénéisé à une suspension uniforme dans l'eau déminéralisée. De l'homogénat découlant de chaque section de moustique, 10 pi a été retenu tandis que l'autre 10 pi a été transféré dans un autoclave séparé tube de 1,5 ml. Les aliquotes séparées ont été soumis à l'extraction d'ADN, soit par le Chelex simplifiée ou de la norme relargage d'extraction protocole 9,10. Le protocole de relargage est dite et largement utilisée car elle emploie des concentrations élevées de sel au lieu de dangereux solvants organiques (tels que le phénol et le chloroforme) pour l'étape de précipitation des protéines au cours de l'extraction d'ADN 9.
Les extraits ont été utilisés comme matrices pour l'amplification par PCR en utilisant des amorces ciblant les arthropodes déshydrogénase mitochondriale nicotinamide adénine dinucléotidenase (NADH) 4 sous-unité du gène (ND4) pour vérifier 11 Qualité ADN, la PCR pour l'identification des espèces d'anophèles gambiae frères et sœurs de 10 et une PCR nichée pour le typage des infections à Plasmodium falciparum 12. Comparaison avec la qualité de l'ADN (ND4) PCR a montré une sensibilité de 93% et une spécificité de 82% pour l'approche Chelex par rapport à la place relargage protocole. Les valeurs correspondantes de sensibilité et de spécificité étaient de 100% et 78%, respectivement, en utilisant frère identification des espèces PCR et 92% et 80%, respectivement pour P. falciparum détection par PCR. Il n'y avait aucune différence significative dans la proportion d'échantillons de signal donnant amplicon avec le Chelex ou le relargage régulier protocole dans toutes les applications PCR trois. L'approche nécessaire Chelex trois réactifs simples et 37 min pour compléter, tandis que l'. Relargage protocole comportait 10 réactifs différents et 2 h et 47 min de temps de traitement ", comprenant une étape de nuit Nos résultats montrent èmeà la méthode Chelex est comparable à celui existant relargage d'extraction et peut être remplacé par une approche simple et durable en pays à ressources limitées où un réactif de la chaîne d'approvisionnement constant est souvent difficile à maintenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode Chelex simplifiée présentée ici permet l'extraction de la qualité des anophèles et P. ADN falciparum à partir de spécimens de moustiques qui se prêtent à diverses applications PCR. Cette technique peut être utilisée pour l'identification moléculaire des moustiques vecteurs du paludisme et de la surveillance de la pharmacorésistance P. allèles falciparum chez les moustiques des programmes nationaux de lutte contre le paludisme. Les avantages de la technique simplifiée Chelex comprennent la simplicité, moins de réactifs et donc le coût, la sécurité et le temps de traitement plus court (37 min) de protocoles standard tels que la méthode de relargage 10 (2 h 47 min et une étape du jour au lendemain, tableau 1). Les avantages mentionnés ci-dessus et les exigences minimales de réactifs (3 réactifs) par rapport au protocole standard actuel (10 réactifs, tableau 1) 11,15, rendre le protocole Chelex simplifiée particulièrement convivial pour les laboratoires des pays d'endémie où un réactif constantchaîne d'approvisionnement est souvent difficile à maintenir. Une limitation de cette méthode est que, comme le protocole standard, il est également soumis à des inhibiteurs de PCR connus pour se produire dans le tégument moustique 16. Toutefois, cela est facilement soulagée par l'inclusion de BSA dans les essais. BSA a également été utilisé avec succès comme un exhausteur d'amplification des inhibiteurs contre dans les applications de PCR autres 17,18.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les chefs, sous-chefs et les communautés de Macha pour leur unwaveing coopérer lors de moustiques collections d'échantillons sur le terrain. Dr Doug Norris et Rebecca Kent a offert une précieuse expertise sur le protocole de relargage. Ce travail a été financé par la Johns Hopkins Malaria Research Institute pilote de système de subvention. Mosquito et parasites ADN normes de laboratoire ont été fournies gracieusement par MR4, American Type Culture Collection &.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
Referenzen
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N’Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
