גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה
Summary
הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.
Abstract
עד כה, היעדר מקור התא האנושי מתאים לב כבר עיכוב משמעותי התחדשות שריר הלב האנושי, או על ידי השתלת תאים מבוססי לב או על ידי הנדסת רקמות 1-3. Cardiomyocytes להיות סופני הבדיל מיד אחרי הלידה מאבדים את יכולתם להתרבות. אין כל עדות כי גזע / ובתאים ממקורות אחרים, כגון מח העצם או דם טבורי, מסוגלים להצמיח לתאי השריר התכווצות הלב לאחר השתלת ללב 1-3. הצורך לחדש או לתקן את שריר הלב ניזוק לא מולאו על ידי טיפול בתאי גזע בוגרים, או אנדוגני או באמצעות משלוח תא 1-3. תאים יציבים גנטית גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת הרחבה בלתי מוגבלת גמישות בלתי מוגבלת, מושיטה מאגר pluripotent שכן הגזירה במבחנה של אספקה גדולה של האדם התאים הסומטיים כי מוגבלים השושלת זקוקיםתיקון והתחדשות 4,5. בשל השכיחות של מחלות לב וכלי דם ברחבי העולם, מחסור חמור של איברים מתורם, יש עניין רב hESC טיפולים מבוססי פיתוח כגישה חלופית. עם זאת, איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent ביעילות כצפוי על הפנוטיפ הרצוי כבר אתגר גדול עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליניים. הגישות המקובלות להסתמך על הנטייה רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent באמצעות בידול נבט ספונטנית שכבה, וכתוצאה מכך מחויבות-השושלת יעיל ובלתי נשלט זה מלווה לעתים קרובות ההטרוגניות יציבות פנוטיפי, ולכן, סיכון גבוה tumorigenicity 6-8 (ראה סכמטית ב איור. 1A). בנוסף, מוגדר תוספי ביולוגיים זרים / חיה ו / או ניזונים, כי יש בדרך כלל נעשה שימוש בבידוד, הרחבה, בידול של hESCs רשאי לעשות שימוש ישיר כזה התא specialiשתלי zed בחולים בעייתי 9-11. כדי להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו צריכים לפתור את האלמנטים של מערכת התרבות מוגדר הכרחי ומספיק לקיום pluripotence epiblast של hESCs, משמש כפלטפורמה הגזירה דה נובו של hESCs קלינית מתאימה ויעילה בימוי hESCs כזה אחיד כלפי שושלות קליני רלוונטי על ידי מולקולות קטנות 12 (ראה סכמטית באיור. 1B). לאחר הקרנת מגוון רחב של מולקולות קטנות, ובדרך גורמי גדילה, מצאנו כי התנאים המוגדרים כאלה שניתנו nicotinamide (NAM) מספיק כדי לעורר את המפרט של cardiomesoderm ישירה hESCs pluripotent כי עוד התקדם cardioblasts שהפיק cardiomyocytes להכות אדם עם יעילות גבוהה (איור 2 ). הגדרנו תנאים אינדוקציה של cardioblasts ישירה hESCs pluripotent ללא שלב להתערב רב השושלת הגוף embryoid, המאפשר מבוקר היטב הגזירה יעיל שלהיצע גדול של תאים הלב האנושי על פני ספקטרום של שלבי ההתפתחות של התא מבוסס הרפוי.
Protocol
Discussion
אחד האתגרים הגדולים עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליני כבר איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של pluripotent בתאי גזע אנושיים הפנוטיפ הרצוי ביעילות כצפוי. למרות תאים כאלה יכולים להבדיל באופן ספונטני במבחנה לתאים של כל שכבות הנבט ידי עובר שלב רב שושלת צבירה, ב hESC הנגזרות רב השושלת אגרגטים (גופים embryoid), רק חלק קטן מאוד של תאים (<2%) באופן ספונטני להתמיין cardiomyocytes 13-15 (איור 1A). בעקבות immunoselection, האוכלוסיות מועשר של cardiomyocytes היו מסוגלים לתפקד כמו קוצבי לב ביולוגיים כדי להציל את תפקוד שריר הלב ניזוק מכנית אלקטרונית בעקבות הזרקה אל לב בבעלי חיים 13. במודלים של מכרסמים infarcted, engrafted hESC הנגזרות progenies לב הצליחו לשרוד ולהתפתח עד 12 שבועות, remuscular חלקיתize את הלב הפצוע ולשפר את תפקוד כויץ 14,15. עם זאת, יעילות ביצירת האדם הלב, מחויב תאים באמצעות בידול רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent לבין סיכון גבוה השתלת tumorigenicity הבאים הפריע התרגום קליניים נוספים. פיתוח אסטרטגיות לערוץ פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent בלעדי כצפוי על הפנוטיפ לב חיונית רתימת העוצמה של הביולוגיה hESC בתחום הלב. על מנת להשיג אחיד ההמרה של אדם בתאי גזע pluripotent לשושלת מסוימת, אנחנו עובדים מערכת תרבות מוגדרת מסוגלים לבטח את הפצת hESCs מובחן לזהות תנאים לזירוז מבוקר היטב יעיל של hESCs pluripotent בלעדי מסוים בשושלת קליני רלוונטי על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות (איור 1B). מצאנו כי nicotinamide המושרה לב, שושלת מחויבות ישירה של phESCs luripotent תחת תרבות מוגדר כי עוד התקדם להכות cardiomyocytes עם יעילות גבוהה (איור 2). Nkx2.5 היא שעתוק נשמרת evolutionally homeobox גורם הכרחי להתפתחות מוטציות לב נורמלי של הגן הקשורים למחלות אנושיות לב מולדים (CHD), את הפגם הנפוץ ביותר הלידה האנושית 16. הביטוי של Nkx2.5 הוא הסמן המוקדם של תאים מבשר לב בכל החוליות שנבדקו עד כה חיונית septation לב ראויה היווצרות / הבשלה של מערכת הולכה חשמלית 16. ב החוליות, הופעת דפוס הביטוי Nkx2.5 מוקדם בערך בקנה אחד עם העיתוי ואת שטח של מפרט הלב של העובר מוקדם, Nkx2.5 גן ממשיכה לבוא לידי ביטוי באמצעות פיתוח בלב 16. במודל hESC שלנו, הופיע NAM כדי לעורר את הלב אינדוקציה ישירה hESCs pluripotent באמצעות קידום הביטוי של הלב ספציפי transcriגורם ption Nkx2.5 בתהליך שעשוי לחקות את המפרט של cardiomesoderm מ epiblast pluripotent ב cardiogenesis עובריים אנושיים. מחקרים עתידיים יגלה מולקולות בקרה גנטית epigenetic בהתפתחות הלב האנושי חלופות, אשר עשוי לסלול את הדרך לשלוט מולקולה בתיווך קטן אפנון ישיר של גורל pluripotent hESC כאשר הנובעות שושלות קליני רלוונטי עבור טיפולים רגנרטיבית. ללא טיפול NAM, <hESCs 2% יעברו התמיינות ספונטנית תוך מכות cardiomyocytes 12-15. באמצעות טיפול NAM, הצלחנו לייצר> 95% מבשרי לב עובריים cardiomyocytes מכות> 50% מן hESCs שמרו תחת תרבות להגדיר בתהליך שעשוי לחקות הלב האנושי ההתפתחות העוברית 12. לאחרונה, ידוע לב, גורל גנים בקביעת שימשו transdifferentiate fibroblasts העכבר לתוך שלאחר הלידה cardiomyocytes מכות עם יעילות נמוכה של 0.5% <17, 18 </ Sup>. עם זאת, reprogrammed התאים הסומטיים יש היסטורית היה קשור ביטוי גנים חריגים להזדקנות מואצת עם התועלת הטיפולית לקויי 19-21. לבסוף, פרוטוקול הקמנו כאן מוגבל hESCs pluripotent נגזר מסת התאים הפנימית (ICM) או epiblast של הבלסטוציסט האנושי 4,5, אינן חלות pluripotent תאים אחרים, כולל בעלי חיים שמקורם ESCs, ESCs נגזר morula מוקדם יותר (שמונה תאים) בשלב עוברי 22, ותאי reprogrammed מלאכותי 23.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XHP כבר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקי המכון הלאומי להזדקנות (NIHK01AG024496) ו יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NIHR21HD056530).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma | L6274 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
Referenzen
- Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
- Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
- Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
- J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. , 282-1145 (1998).
- Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
- Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
- Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
- Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
- Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
- Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O’Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
- Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
- Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
- Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
- Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
- Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
- Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
- Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
