PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

1. הדגימה איסוף שימור שיטה זו פותחה נבדק באמצעות טריים, קפואים, מיובשים ורקמות עלה לאחרונה. זהה את cogongrass ו / או JBG רקמות בעזרת הטקסונום המתמחה זיהוי מינים הדשא. עם עלים בצבע אדום בהיר שלה, JBG נוי קל ויזואלית להבחין בין wild-type cogongrass ו JBG לחזור, אך cogongrass ו JBG לחזור הם נבדלים זה מזה כמעט. Cogongrass ואת הפנוטיפ JBG חזרו להיות ירוקים, עלים ארוכים יותר, קני שורש משמעותית גדולים יותר ויותר, ושטח עלה יותר מ JBG 12 (איור 1). רקמת העלה טרי מספק את ה-DNA הנפוץ ביותר באיכות הגבוהה ביותר ניתן שנאספו בשדה או בחממה א גדל cylindrica צמחים. אם רקמה טרי היא לשמש, לחלץ DNA תוך 3 שעות של אוסף כדי למנוע השפלה. אחרת, להכין את הרקמה לאחסון, keeping רקמות קריר הרחק מאור שמש ישיר. כדי לאחסן רקמות להפקת DNA במועד מאוחר יותר, השיטה האופטימלית ביותר היא להקפיא ולאחסן את הרקמה ב -80 ° C באופן מיידי. אל תאפשר רקמות קפוא להפשיר לפני מיצוי DNA. להעביר את הרקמה הקפואה אל חנקן נוזלי לפני הצעדים שחיקה של מיצוי DNA כדי למנוע הפשרה. אם המקפיא -80 ° C אינו זמין, יבש רקמות באופן מיידי. לאחסון יבש, הצב את רקמת למעטפה נייר ולאחסן את המעטפה סיליקה ג'ל או מיובש desiccants פעילים אחרים בטמפרטורת החדר. כמות קטנה של סיליקה מדד מעורב עם שאינו מצביע סיליקה סיליקה יבטיח כי הוא מיובש לחלוטין מתאים ייבוש רקמות הצמח. השתמש לפחות 10 פעמים סיליקה ג'ל יותר רקמת העלה טרי לפי משקל. רקמת הצמח צריך להתייבש בתוך 24 שעות. האיכות והכמות של ה-DNA הוא מופחת באמצעות אחסון יבש לאורך זמן (כמו במקרה של הדגימה העשבייהs). 2. הפקת DNA כדי לחלץ דנ"א רקמות הצמח, בצע את הצמח DNeasy מיני קיט (Qiagen, ולנסיה, CA, חתול # 69104 או 69106) הוראות היצרן עם שינויים קטין אחד. במקום להשתמש הציע פחות מ 100 מ"ג רקמה טרי או פחות מ 20 מ"ג רקמה יבשה עבור כל עמודה, לטחון יותר מ 100 מ"ג, ולאחר מכן להעביר 100 מ"ג מרקמות טרי או קפוא (או> 20 מ"ג מרקמות יבש) לצינורות המתאימים עבור החילוץ. ה-DNA הגרעיני plastid מופק בו זמנית. לפני תחילת הליכים אלה, ודא כי אתנול נוספה מאגרים AP3 / E ו AW. טוחנים> 100 מ"ג של רקמת העלה טרי או קפוא (או> 20 מ"ג של רקמת העלה יבש) לאבקה דקה באמצעות שלושה סיבובים של חנקן נוזלי עם טחינה במכתש ועלי צונן. הפרעה מספקת של חומר המוצא או תמוגה מספיק יכול גם להוביל בתשואות נמוכות יותר של ה-DNA. בזהירות לטחון tissUE ולא להעמיס את העמודות עם רקמות יותר מדי. העברת 100 מ"ג אבקת קפוא מרקמות טרי או קפוא (או 20 מ"ג של אבקת מרקמות יבש) לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 400 μl של מאגר AP1 ו 4 μl של RNase א כל שפופרת ניתן לשים מדף קטן לאזן לפקח על המשקל הנכון של רקמות לכל צינור. מדגם וורטקס תנער (ים) לערבב דגירה של 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, צינור היפוך (ים) 2-3 פעמים במהלך הדגירה. הוסף 130 μl של מאגר AP2 מדגם זה. מערבבים על ידי צינור היפוך (ים) כמה פעמים, דגירה של 5 דק 'על הקרח. Pipet כל lysate לתוך עמודה QIAshredder נפרדת מיני ספין, ומניחים כל עמודה צינור מ"ל 2 אוסף (מסופק עם הערכה). צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 2 דקות על XG 20000 (~ 14,000 סל"ד), ולהעביר את כל הזרימה דרך חלק לתוך צינור חדש (לא מצורף בערכה) מבלי לשבש כל גלולה נוצר. הוסף 1.5 כרכים של מאגר AP3 /, E ומערבבים ידי pipetting. העברת 650 μl של התערובת בעמודת ספין DNeasy מיני בצינור מ"ל 2 אוסף. צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 1 דקות ב XG 6000 (~ 8000 סל"ד), וזורקים את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו עם התערובת שנותרה על מדגם זה. מניחים את הטור ספין (ים) לתוך צינור חדש מ"ל 2 אוסף (ים), ולהוסיף 500 μl של AW מאגר לחלק העליון של כל עמודה. צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 1 דקות ב XG 6000 (~ 8000 סל"ד), וזורקים זרימה דרך. הוסף μl 500 של AW מאגר לחלק העליון של כל עמודה. סרכזת דקות 2 ב XG 20000 (~ 14,000 סל"ד). צעד זה ייבש את הטור, ובכך להסיר כל אתנול שיורית הכלול מאגרים שיכול לעכב PCR. העברת כל עמודה ספין כדי צינור חדש microcentrifuge 1.5 מ"ל דגימה. הוסף 100 μl AE מאגר לחלק העליון של כל עמודה עבור elution, ו דגירה עמודה (ות) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 1 דקות ב XG 6000 (~~~HEAD=NNS 8,000 סל"ד) לאסוף את ה-DNA. חזור על elution השלבים פעם אחת, משחררי דנ"א לתוך צינור מ"ל זהה 1.5 microcentrifuge להניב 200 μl של המדגם. דגימות דנ"א חנות ב -20 ° C עד השימוש. ריכוזי ה-DNA תלויה בסוג הרקמה ותנאי אחסון. תשואות אופטימליות מתקבלים כאשר משחררי DNA עם סך של 200 μl של חיץ AE, עם זאת, בריכוזים ניתן להגדיל כמויות אם elution מופחתים μl קטנה כמו 50. 3. אימות של איכות וכמות ה-DNA לבדוק את האיכות והכמות של דנ"א חילוץ לפני ההתקנה PCR באמצעות ספקטרופוטומטר או fluorometer ו אלקטרופורזה בג'ל. זה יעזור להבטיח את הצלחת השלבים הבאים. שימוש, ספקטרופוטומטר בדיקת DNA איכות וכמות. תשואות ה-DNA טוב צריך להיות בין 50 ל 150 ng / μl עם 260/280 ו – 230/280 יחס קרוב ל 2.0. לדוגמה, תרשים 2 מציג תוצאות באיכות טובה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE). לבצע באמצעות אלקטרופורזה בג'ל רגיל 1% agarose. ודא נוכחות של להקות גדולות יחסית (> 10 Kb) עם שום נמרח קצת זיהום RNA (איור 3). אם ריכוז ה-DNA הוא גבוה, דגימות DNA לדלל עד 70 ng / μl על הצעדים הבאים. 4. PCR primers Primers את ה-PCR נעשה שימוש בפרוטוקול זה מבוססות על הבדלים רצף בין אזור trnL-F plastid spacer של גנוטיפים cogongrass ו JBG. הבדלים אלה באים בצורה של SNPs (פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד) ו InDels (הוספות ומחיקות) שאפשרו את התפתחות מגוון ספציפיים primers ידי איתור primers באתרי רצפים ייחודיים (איור 4). איכות primers את יכולה להיות השפעה משמעותית על תוצאות ה-PCR. סדר primers מחברה מכובדת. אנחנו מזמינים primers שלנו אלכסוני ביו, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), מבקש רק desalting הליכים סטנדרטיים. trnL-F primers בקרה חיוביות: קבוצה זו תחל מגביר את האזור plastid trnL-F spacer של מינים הדשא ביותר 11-13 ומשמש בקרה חיובית טוב (וכתוצאה מכך הלהקה נ"ב 890). שם רצף trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 " trnL (אקסון '5), C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 " Wild-type primers cogongrass: אלה קבעו פריימר ספציפי cogongrass ולא להגביר את האזור F trnL של JBG גנוטיפים. את סט התוצאות הלהקה כי הוא 595 נקודות בסיס. שם SEQuence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 " trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 " JBG ו JBG בטל primers: זו קבוצה פריימר ספציפי JBG גנוטיפ ולא להגביר את האזור F trnL של cogongrass. את סט התוצאות הלהקה כי הוא 594 נקודות בסיס. שם רצף trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 " trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 " Resuspend כל צבע יסוד בהיקף מספיק nuclease ללא DDH 2 O להשיג 100 מניות מ"מ פתרונות שניתן לאחסן ב -20 ° C, לטווח ארוך. לדלל כל המניות תחל מ"מ 12 לפני שלבי ההתקנה ה-PCR. 5. הגדרת ה-PCR ה-DNA עקירות הם מוגבר באמצעות כל אחד מגדיר פריימר לעיל PCR תגובות. כלול שליטה חיובית על מנת להבטיח כי כל ריאגנטים ה-PCR עובד טוב יכול ליצור הלהקה. כלול שליטה שלילי על מנת להבטיח שאף אחד ריאגנטים הם מזוהמים DNA לא רצוי. שליטה שלילית מכיל ללא תבנית ויש גורמת לייצור לא הלהקה. הכן את כל התגובות דק דופן צינורות ה-PCR על מנת לאפשר העברת חום טובה יותר בין גוש thermocycler ואת המדגם. אנו ממליצים להשתמש זמינים מסחרית אירוסול ללא טיפים פיפטה כדי למנוע זיהום. עבור מדגם זה ה-DNA בודד, הקים 50 תגובות μl ה-PCR באמצעות כל אחד מגדיר פריימר הנ"ל ב דק דופן צינורות 0.2-מ"ל ה-PCR על ידי הוספת חומרים כימיים הבאים על הקרח כדי המפורטים להלן. אם דוגמאות רבות נמצאים בהכנה, את קוקטייל המכיל את כל חומרים כימיים, למעטשל תבנית דנ"א כדי לקבוע תנאים אחידים בין כל התגובות. PCR מגיב נפח משומשים סופי Concetration Nuclease ללא DDH 2 O 40.5 μl 10X Advantage 2 PCR חוצץ (Clonetech, CA) 5.0 μl 10% (V / V) היתרון ultrapure PCR dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחד, Clonetech, CA) 1.0 μl 0.2 מ"מ פריימר 1 (12μM ב DDH 2 O) 1.0 μl 0.24 מיקרומטר פריימר 2 (12μM ב DDH 2 O) 1.0 μl 0.24 מיקרומטר 2 היתרון פולימראז Mix (Clonetech, CA) 0.5 μl 1% (V / V) מיצוי DNA(70 ng / תגובה: לשנות DDH 2 O נפח לפי הצורך) 1.0 μl 1.4 ng / μl סה"כ: 50.0 μl על מנת להבטיח כי כל ריאגנטים ה-PCR עובד היטב, להגדיר את השליטה חיובית באמצעות primers בקרה חיוביים. זו קבוצה פריימר עובד לא פחות טוב cogongrass, JBG, JBG לחזור ועשבים אחרים תגרום הלהקה כלומר 890 נקודות בסיס. הגדרת הבקרה השלילית באמצעות פריימר אותה שליטה כאמור שליטה חיובית, תוך שימוש DDH 2 O במקום מיצוי DNA. אם ריאגנטים כל חופשיים של DNA מזהם, התגובה הזו תגרום הלהקה לא. אם ריכוז ה-DNA הוא נמוך, ה-DNA יותר ניתן להוסיף כל תגובה, התאמת כמות nuclease ללא DDH 2 O נהג להביא את עוצמת התגובה סך μl 50. אין להשתמש יותר מ 5 μl של ה-DNA (10% הנפח הכולל) לכל Reaction, זיהומים כמו האפשריים הכלולים דגימות DNA יכול לעכב PCR תגובות. 6. PCR אופניים ביצוע amplifications PCR ב thermocycler מצויד במכסה מחוממת באמצעות הפרמטרים הבאים ה-PCR אופניים. אנו משתמשים Pro Mastercycle S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, ניו יורק) מוגדר לפעול בתנאים סטנדרטיים ramping הטמפרטורה. כל thermocycler איכות צריך ביצועים טובים. מחזור Denaturation חישול פילמור 1 2 דק 'ב 95 ° C 2 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס 30 שניות על 61 מעלות צלזיוס 90 שניות על 68 מעלות צלזיוס 35 מחזורים 3 5 דק 'ב 68 ° C להחזיק ב 4 ° C עד המדגם מוסר </TD> לייעל את התנאים PCR (כולל טמפרטורת צבע יסוד חישול, פעמים הרחבה, ומספר מחזורי) לפי הצורך בהתאם לאיכות של ה-DNA, primers, פולימראז Taq או סוג של thermocycler בשימוש. אנו ממליצים להשתמש thermocycler מסוגל שיפוע בעת קביעת אופטימלי חישול בטמפרטורה. אם thermocycler בשימוש אין מכסה מחוממת, להוסיף 1 טיפה של שמן מינרלי לחלק העליון של מדגם זה על מנת למנוע אידוי בעת רכיבה על אופניים PCR. 7. ג'ל אלקטרופורזה של PCR מוצרים כדי להמחיש את תוצאות הניתוח, נפרדים מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose 1% באמצעות אלקטרופורזה רגילה. שלב 2 μl של מאגר ה-DNA תקן הטעינה (בדרך כלל פתרון או 5x 6x) עם 5 μl של כל מוצר PCR מוגבר. טען דגימות על 1% agarose ג'ל המכיל EtBr (ברומיד ethidium עבור מכתים DNA) עשה עם הither טה או SB (borate נתרן) חיץ מערכות 16. אנו משתמשים 1 μl של פתרון EtBr 10 מ"ג / מ"ל ​​המניות לכל 100 מ"ל agarose 1% (0.1 מיקרוגרם / מ"ל). הפעל דגימות ב ~ 120V עד לפני צבע מגיע ¾ באורך כולל של ג'ל. תחת אור UV (למשל גל קצר UV תיבת אור), לבדוק את להקות כתוצאה לראות אם שבר המתאים היה מוגבר. לתעד את הג'ל להקות וכתוצאה מכך באמצעות המערכת זמינה צילום תיעוד או מצלמה. 8. נציג תוצאות עם ויזואליזציה של מוצרי ה-PCR, cogongrass יש דפוס פסים ייחודי בהשוואה לזו של JBG או חזרו JBG (איור 5). עבור מדגם זה ה-DNA, trnL-F קבוצה חיובית פריימר השליטה צריכים להביא הלהקה בעוצמה גבוהה יחיד ~~~HEAD=NNS 890 נ"ב. זה מוודא כי כל ה-PCR ריאגנטים פועלות כראוי. כמו כן, השליטה תגובה שלילית (ללא תבנית) צריך להכיל לא להקות עבור כל צבע יסוד שלet בשימוש. זה מוודא שאף אחד ריאגנטים היו מזוהמים. אם דגימת DNA נגזר wild-type cogongrass, תגובת PCR באמצעות מערכת cogongrass ספציפי פריימר תגרום להקה אחת ב ~ 595 BP בעוד JBG ספציפיים primers תגרום הלהקה לא. כמו כן, אם דגימת DNA נגזר JBG או חזרו JBG, תגובת PCR באמצעות מערכת JBG ספציפי פריימר תגרום להקה אחת ב ~ 594 BP בעוד cogongrass ספציפיים primers תגרום הלהקה לא. בגלל JBG וחזרו JBG יש חומצה זהה רצף גרעין, הם לפיכך יש דפוסי שהתקבצו זהים. אם דוגמאות רבות כדי להשוות על ג'ל בעת ובעונה אחת, אנו ממליצים להפעיל את כל דגימות הנגזרות פריימר כל קבוצה זה לצד זה, ובכך קל יותר לסרוק את הדגימות עבור תוצאות חיוביות. הבדלים מורפולוגיים בין JBG ו JBG חוזר ברורות למדי (למשל, הצבע האדום של העלים קומה נמוכה של JB G לעומת צבע ירוק, שיעור קומה גדול יותר וצמיחה אגרסיבית של JBG לחזור), אז בעוד תוצאות ה-PCR יהיה אותו דבר, הזנים JBG קל להבחין באמצעות מבנה הצמחים. באיור 1. השוואת החממה גדלה Imperata cylindrica var. Koenigii (עשב דם יפני), הוחזר א cylindrica var. koenigii (JBG החזר) ואני cylindrica (wild-type cogongrass). איור 2. דוגמה דגימות דנ"א לאמת באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. שימו לב, בלי קשר ספקטרופוטומטר שימוש, יחס 260/280 צריך להיות קרוב ל -1.8 והיחס 260/230 יש קרוב 2.0. ontent "> באיור 3. דגימות DNA אומת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל רגיל על ג'ל agarose 1%. סמן דנ"א מסחרי שימש ניתוח גודל. ליין מס '4 הוא דוגמה מדגם באיכות ירודה DNA, מראה מריחות וכמה זיהום RNA. באיור 4. יישור רצף של trnL-F אזורי Imperata cylindrica var. Koenigii (עשב דם יפני), הוחזר א cylindrica var. koenigii (JBG החזר) ואני cylindrica (wild-type cogongrass). חיצים שחורים אנכיים מציינים הבדלים רצפים הנובעות SNPs ו InDels. החצים הירוקים האופקיים מציינים את עמדותיהם של wild-type primers cogongrass המשמשים cogongrass ספציפי PCR. החיצים האדומים מציינים את אופקי poוחיבורים של JBG ו JBG בטל פריימרים המשמשים JBG ספציפי PCR. איור 5. תוצאה נציג ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR הנגזרות cogongrass, JBG ו JBG לחזור דגימות DNA בשילוב עם cogongrass-and JBG ספציפיים primers וכן trnL-F בקרה חיובית מלאה כל תבנית שלילית.