Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica</em

1. Probenentnahme und Konservierung Diese Methode wurde entwickelt und getestet, mit frisch, gefroren, getrocknet und vor kurzem Blattgewebe. Identifizieren cogongrass und / oder JBG Gewebe mit Hilfe eines Taxonomen, die im Gras Artbestimmung spezialisiert. Mit seinen leuchtend roten Blättern, ist einfach zu ornamentalen JBG optisch von Wildtyp-und cogongrass JBG unterscheiden zurückgreifen, jedoch sind cogongrass und JBG zurückkehren kaum von einander. Cogongrass und der JBG zurückgekehrt Phänotyp haben grün, Blätter länger, wesentlich größer und länger Wurzelstöcke, und vieles mehr Blattfläche als JBG 12 (Abbildung 1). Frische Blattgewebe bietet die am häufigsten vorkommende und höchste Qualität DNA und kann von Feld oder Gewächshaus angebaut I. abgeholt werden cylindrica Pflanzen. Wenn frisches Gewebe verwendet werden soll, Extraktion von DNA innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme, um zu verhindern Abbau. Ansonsten bereiten Gewebe für die Lagerung, keeping das Gewebe kühl und vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt. Um Gewebe zur DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt zu speichern, ist die optimale Verfahren zum Einfrieren und Speichern des Gewebes bei -80 ° C unmittelbar. Lassen Sie das gefrorene Gewebe zu tauen, bevor die DNA-Extraktion. Übertragen Sie die gefrorenen Gewebe zu flüssigem Stickstoff vor den Schleifen Schritte der DNA-Extraktion zu verhindern Auftauen. Wenn ein -80 ° C Gefrierschrank ist nicht verfügbar, sofort trocken das Gewebe. Zur Aufbewahrung, ein Gewebe in einer Papierhülle und speichern den Umschlag in getrocknetem Kieselgel oder andere aktive Trockenmittel bei Raumtemperatur. Eine kleine Menge des Indikators Siliciumdioxid gemischt mit nicht anzeigenden Siliciumdioxid wird sichergestellt, dass Siliciumdioxid vollständig dehydriert und für Trocknen Pflanzengewebe. Verwendung von mindestens 10 mal mehr Kieselgel als frische Blattgewebe Gew.. Pflanzengewebe sollte innerhalb von 24 Stunden trocknen lassen. Die Qualität und Quantität der DNA durch trockene Lagerung im Laufe der Zeit reduziert werden (wie im Fall von Herbarium-Exemplare). 2. DNA-Extraktion Um DNA aus Pflanzengewebe zu extrahieren, folgen Sie dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 oder 69106) den Anweisungen des Herstellers mit einer kleinen Modifikation. Anstelle der Verwendung der vorgeschlagenen weniger als 100 mg frischem Gewebe oder weniger als 20 mg trockenes Gewebe für jede Spalte, schleifen größer als 100 mg, und übertragen Sie dann 100 mg von frischem oder gefrorenem Gewebe (oder> 20 mg von trockenen Geweben) in die entsprechenden Röhrchen für die Extraktion. Kern-und Plastiden-DNA wird gleichzeitig extrahiert. Bevor Sie diese Vorgänge, stellen Sie sicher, dass Ethanol wurde auf Puffer AP3 / E und AW aufgenommen. Grind> 100 mg von frischem oder gefrorenem Blattgewebe (oder> 20 mg trockenes Blattgewebe) zu einem feinen Pulver mit drei Runden von flüssigem Stickstoff mit Schleifen in einem gekühlten Mörser und Stößel. Zu wenig Störung des Ausgangsmaterials oder unzureichende Lyse kann auch führen zu niedrigeren Ausbeuten an DNA. Vorsichtig schleifen die TISSue und nicht überlasten die Spalten mit zu viel Gewebe. Übertragen Sie 100 mg gefrorene Pulver aus frischen oder gefrorenen Gewebe (oder 20 mg Pulver von trockenen Geweben) zu einem 1.5 ml Zentrifugenröhrchen mit 400 ul Puffer AP1 und 4 ul RNase A. Jedes Rohr in einem kleinen Schrank auf einer platziert werden können auszugleichen, um die korrekte Gewicht des Gewebes pro Röhre zu überwachen. Schütteln oder Probe (n) zu mischen und Inkubation für 10 min bei 65 ° C, Umdrehen des Röhrchens (en) 2-3 mal während der Inkubation. Fügen Sie 130 ul Puffer AP2 zu jeder Probe. Mischen durch Invertieren des Röhrchens (n) mehrmals, und Inkubation für 5 min auf Eis. Pipettieren Sie jeweils Lysat in ein separates QIAshredder Mini Spin-Säule, und platzieren Sie jede Spalte in einer 2-ml-Collection-Tube (im Lieferumfang des Kits). Zentrifugen-Spalte (n) für 2 min bei 20.000 xg (~ 14.000 rpm), und transferieren jede Flow-Through-Fraktion in eine neue Röhre (nicht im Kit enthalten) ohne Unterbrechung jedes Pellet gebildet. In 1,5 Volumina Puffer AP3 /E, und durch Pipettieren gründlich mischen. Übertragen Sie 650 ul der Mischung in eine DNeasy Mini Spin-Säule in ein 2 ml Collection Tube. Zentrifugen-Spalte (n) für 1 min bei 6.000 xg (~ 8.000 Umdrehungen pro Minute), und entsorgen Sie die Flow-Through. Wiederholen Sie diesen Schritt mit der restlichen Mischung für jede Probe. Legen Sie die Spin-Säule (n) in ein neues 2 ml Collection Tube (n), und fügen Sie 500 ul Puffer AW auf der Oberseite jeder Spalte. Zentrifugen-Spalte (n) für 1 min bei 6.000 xg (~ 8.000 Umdrehungen pro Minute), und entsorgen Sie Flow-Through. Fügen Sie eine weitere 500 ul Puffer AW auf der Oberseite jeder Spalte. Säule für 2 min bei 20.000 × g (~ 14.000 rpm). Dieser Schritt wird die Säule trocknen, so dass jedes restliche Ethanol in den Puffern, die PCR inhibieren kann enthalten. Übertragen Sie jede Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Probenröhrchen. Geben Sie 100 ul Puffer AE an die Spitze jeder Säule für die Elution, und inkubieren Spalte (n) für 5 min bei Raumtemperatur. Zentrifuge Spalte (n) für 1 min bei 6.000 × g (~ 8.000 rpm), um die DNA zu sammeln. Wiederholen Sie diese Schritte einmal Elution, Elution der DNA in der gleichen 1.5 ml Zentrifugenröhrchen zu 200 ul Probe ergeben. Shop DNA-Proben bei -20 ° C bis zur Verwendung. DNA-Konzentrationen sind abhängig von Gewebetyp und Lagerbedingungen. Optimale Ausbeuten werden erzielt, wenn eluierenden DNA mit einem Gesamtvolumen von 200 ul Puffer AE, jedoch Konzentrationen können erhöht werden, wenn Elutionsvolumen, so wenig wie 50 pl werden reduziert werden. 3. Nachweis der DNA-Qualität und Quantität Testen Sie die Qualität und Quantität der extrahierten DNA vor der PCR-Setup mit einem Spektralphotometer oder Fluorimeter und Gelelektrophorese. Dies wird dazu beitragen, den Erfolg der weiteren Schritte. Mit einem Spektralphotometer, Test-DNA-Qualität und Quantität. Gute Ausbeuten DNA sollte zwischen 50 und 150 sein ng / ul mit 260/280 und 230/280-Verhältnisse von ca. 2,0. Als Beispiel zeigt Abbildung 2 qualitativ hochwertiger Ergebnisse mit dem NanoDrop Spektralphotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE). Führen Elektrophorese unter Verwendung eines Standard-1% Agarosegel. Überprüfen Sie das Vorhandensein von relativ großen Bands (> 10 Kb) mit nicht zu kleinen Schlieren von RNA-Kontamination (Abbildung 3). Wenn die DNA-Konzentration hoch ist, verdünnter DNA-Proben auf 70 ng / ul für die nachfolgenden Schritte. 4. PCR-Primer Die PCR-Primer in diesem Protokoll verwendet werden auf Sequenzunterschiede zwischen dem Plastid trnL-F Spacer-Region der cogongrass und JBG Genotypen bezogen. Diese Unterschiede in der Form von SNPs (single nucleotide polymorphisms) und indels (Einfügungen und Löschungen), die die Entwicklung von Vielfalt-spezifische Primer durch Platzierung der Primer an den Standorten der einzigartigen Sequenzen (Abbildung 4) erlaubt zu kommen. Die Qualität der Primer können einen erheblichen Einfluss auf die PCR-Ergebnisse. Bestellen Primer von einem seriösen Unternehmen. Wir bestellen unsere Primern aus Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), Anfordern nur Standard-Verfahren entsalzt. trnL-F positive Kontroll-Primer: Primer-Set Dieser verstärkt das plastidäre trnL-F Spacer-Region der meisten Taxa 11-13 Gras und dient als gute positive Kontrolle (was zu einem 890 bp-Bande). Name Reihenfolge trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5'-Exon)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' Wildtyp-Primer cogongrass: Diese Primer sind zu cogongrass und nicht verstärken die trnL-F-Region von JBG Genotypen. Die eingestellten Ergebnisse in einer Band, die 595 bp ist. Name Sequss trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG und JBG Revert Primer: Diese Primer sind zu JBG Genotyp und nicht verstärken die trnL-F Region cogongrass. Die eingestellten Ergebnisse in einer Band, die 594 bp ist. Name Reihenfolge trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' Resuspendieren in jeder Primer ausreichend Volumen der Nuclease-freiem ddH 2 O, um eine 100 mM Stammlösungen, die bei -20 ° C, langen Zeitraum gelagert werden kann erhalten. Verdünnen Sie jedes Primer-Lager bis 12 mm vor dem PCR-Setup-Schritte. 5. PCR-Setup DNA-Extraktionen sind amplifiziert unter Verwendung jeder der obigen Primer-Sets in PCR-Reaktionen. Fügen Sie eine positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien arbeiten gut und kann eine Band zu erzeugen. Fügen Sie eine negative Kontrolle, um sicherzustellen, dass keines der Reagenzien mit unerwünschten DNA kontaminiert sind. Die negative Kontrolle enthält kein-Vorlage und sollten in keiner Band Produktion führen. Bereiten Sie alle Reaktionen in dünnwandigen PCR-Gefäße zur besseren Wärmeübergang zwischen dem Thermocycler-Block und der Probe zu ermöglichen. Wir empfehlen die Verwendung kommerziell erhältlichen Aerosol-freie Pipettenspitzen zur Vermeidung von Kontamination. Für jede DNA-Probe isoliert, bis 50 pl PCR-Reaktionen mit jeder der oben genannten Primer-Sets in 0,2-ml dünnwandigen PCR-Gefäße, indem die folgenden Reagenzien auf Eis in der unten angegebenen Reihenfolge eingestellt. Wenn mehrere Proben hergestellt werden, machen einen Cocktail enthält alle Reagenzien, mit Ausnahmeder DNA-Vorlage, um einheitliche Bedingungen zwischen allen Reaktionen. PCR Reagenz Volumen der eingesetzten Abschließende Konzentrationsvermögen Nuklease-freiem ddH 2 O 40,5 ul Vorteil 2 10X PCR-Puffer (Clontech, CA) 5,0 ul 10% (v / v) Vorteil UltraPure PCR-dNTP-Mix (jeweils 10 mM, Clonetech, CA) 1,0 ul 0,2 mM Primer 1 (12 &mgr; m in ddH 2 O) 1,0 ul 0,24 pM Primer 2 (12 &mgr; m in ddH 2 O) 1,0 ul 0,24 pM Vorteil 2 Polymerase Mix (Clontech, CA) 0,5 ul 1% (v / v) DNA-Extraktion(70 ng / Reaktion; anpassen ddH 2 O Volumen je nach Bedarf) 1,0 ul 1,4 ng / ul Gesamt: 50,0 ul Um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien sind gut klappt, richten die positive Kontrolle mit Hilfe der positiven Kontroll-Primer. Diese Primer-Set funktioniert genauso gut für cogongrass, JBG, JBG zurückkehren und andere Gräser und werden in einer Band, die 890 bp führen. Richten die negative Kontrolle unter Verwendung der gleichen Kontroll-Primer als positive Kontrolle eingestellt, mit ddH 2 O anstelle der DNA-Extraktion. Wenn alle Reagenzien frei von DNA verunreinigt sind, wobei diese Reaktion in keiner Band führen. Wenn die DNA-Konzentration niedrig ist, können weitere DNA zu jeder Reaktion gegeben werden, die Anpassung der Menge an Nuklease-freiem ddH 2 O verwendet, um das gesamte Reaktionsvolumen auf 50 ul zu bringen. Verwenden Sie nicht mehr als 5 mu l DNA (10% der das Gesamtvolumen) pro reaction, als mögliche Verunreinigungen in den DNA-Proben enthaltenen PCR-Reaktionen zu inhibieren. 6. PCR-Cycling Führen Sie die PCR-Amplifikationen in einem Thermocycler mit beheizbarem Deckel mit folgendem PCR-Cycling-Parameter ausgestattet ist. Wir verwenden die Mastercycle Pro S Thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) gesetzt, um mit Standard-Temperaturrampen Bedingungen zu arbeiten. Jede Qualität Thermocycler sollten gute Leistungen. Zyklus Denaturierung Annealing Polymerisation 1 2 min bei 95 ° C 2 30 Sekunden bei 95 ° C 30 Sekunden bei 61 ° C 90 s lang bei 68 ° C 35 Zyklen 3 5 min bei 68 ° C Halten bei 4 ° C, bis die Probe entnommen </td> Optimieren der Bedingungen für die PCR (einschließlich Primer Annealing-Temperatur, Verlängerungszeiten, die Anzahl der Zyklen) nach Bedarf in Abhängigkeit von der Qualität der DNA, Primer, verwendet Taq-Polymerase oder Art der Thermocycler. Wir empfehlen unter Verwendung eines Gradienten in der Lage Thermocycler bei der Bestimmung der optimalen Glühtemperaturen. Wenn der verwendete Thermocycler keinen beheizbaren Deckel, 1 Tropfen Mineralöl auf der Oberseite jeder Probe der Verdunstung während der PCR-Cycling zu verhindern. 7. Gel-Elektrophorese von PCR-Produkten Um die Ergebnisse der Analyse visualisieren, getrennte PCR-Produkte auf einem 1% Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren. Kombinieren Sie 2 ul einer Standard-DNA-Ladepuffer (typischerweise ein 5x oder 6x-Lösung) mit 5 ul jeder amplifizierte PCR-Produkt. Laden Proben auf ein 1% Agarosegel, das Ethidiumbromid (Ethidiumbromid zum Anfärben der DNA) mit e gemachtither TAE oder SB (Natriumborat) Puffersysteme 16. Wir verwenden 1 ul einer 10 mg / ml EtBr Stammlösung pro 100 ml 1% Agarose (0,1 ug / ml). Führen Proben bei ~ 120 V, bis der Farbstoff vor ¾ des gesamten Länge des Gels. Unter UV-Licht (z. B. eine kurzwellige UV-Lichtbox) auch die resultierenden Banden zu sehen, ob eine entsprechende Fragment amplifiziert. Dokumentieren Sie das Gel und die daraus resultierenden Bänder mit einer der verfügbaren Foto-Dokumentations-System oder eine Kamera. 8. Repräsentative Ergebnisse Nach Darstellung der PCR-Produkte, hat eine einzigartige cogongrass Bandenmuster im Vergleich zu der JBG oder zurückgesetzt JBG (5). Für jede DNA-Probe sollte die trnL-F Positivkontrolle Primer-Set in einem einzigen Band mit hoher Intensität bei ~ 890 bp führen. Diese prüft, ob alle PCR-Reagenzien gut funktionieren. Ebenso sollte die negative Kontrolle (kein Template)-Reaktion enthalten keine Banden für jedes Primer-set. Dadurch wird bestätigt, dass keines der Reagenzien wurden kontaminiert. Wenn die DNA-Probe von Wildtyp-cogongrass, eine PCR-Reaktion mit dem cogongrass-spezifische Primer in einer einzelnen Bande bei ~ 595 bp führen, während die JBG-spezifischen Primern in keiner Band führen abgeleitet. Ebenso, wenn die DNA-Probe von JBG abgeleitet ist oder zurückgesetzt JBG, ein PCR-Reaktion unter Verwendung der JBG-spezifische Primer in einer einzelnen Bande bei ~ 594 bp führen, während die cogongrass-spezifischen Primern in keiner Band führt. Weil JBG und kehrte JBG identisch Nukleinsäuresequenz haben, werden sie daher über identische Bandenmuster. Wenn viele Proben auf einem Gel zur gleichen Zeit verglichen werden sollen, empfehlen wir, alle Proben von jedem Primer gesetzt nebeneinander abgeleitet, wodurch es einfacher, die Proben für die positiven Ergebnisse zu scannen. Morphologischen Unterschiede zwischen JBG JBG und kehrt ziemlich offensichtlich sind (z. B. rote Farbe der Blätter und kleinere Statur von JB G gegen den Rest der Grünfärbung, größerer Statur und aggressive Wachstum der JBG zurück), so dass während der PCR-Ergebnisse die gleichen sein werden, sind die JBG Sorten leicht zu unterscheiden Verwendung Pflanzenmorphologie. Abbildung 1. Vergleich von Gewächshaus gezogen Imperata cylindrica var. Koenigii (Japanese Blut Gras), kehrte I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) und I. cylindrica (Wildtyp cogongrass). 2. Ein Beispiel von DNA-Proben überprüft unter Verwendung eines Spektrophotometers NanoDrop. Beachten Sie, dass, unabhängig von der verwendeten Spektrophotometers, das 260/280 Verhältnis sollte in der Nähe 1,8 sein und die 260/230 Ratio soll bei 2,0 zu schließen. NHALT "> 3. DNA-Proben mit Standardmethoden Gel-Elektrophorese auf einem 1% igen Agarosegel. Eine kommerzielle DNA-Marker wurde für Größe Analyse verwendet. Lane # 4 ist ein Beispiel von schlechter Qualität DNA-Probe, zeigt, Verschmieren und einige RNA-Kontamination. Abbildung 4. Sequenzvergleiche der trnL-F Regionen Imperata cylindrica var. Koenigii (Japanese Blut Gras), kehrte I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) und I. cylindrica (Wildtyp cogongrass). Vertikale schwarze Pfeile zeigen Unterschiede in den Sequenzen, die sich aus SNPs und indels. Horizontal grünen Pfeile zeigen die Positionen der Wildtyp-Primer für cogongrass cogongrass-spezifischen PCR verwendet. Horizontale roten Pfeile zeigen die potungen der JBG und JBG Revert Primer für JBG-spezifische PCR eingesetzt. Bild 5. Repräsentative durch Gelelektrophorese von PCR-Produkten aus cogongrass abgeleitet, und JBG JBG wieder DNA-Proben mit cogongrass und JBG-spezifischen Primern sowie die trnL-F positive Kontrolle und eine negative Kontrolle ohne Matrize kombiniert.