والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em
Summary
ونحن نقدم فعالة من حيث التكلفة وسريعة بروتوكول التنميط الجيني التي توظف متنوعة محددة الاشعال PCR أن الاختلافات الهدف تسلسل الحمض النووي داخل المنطقة هل بلاستيدات trnL-F للتمييز بين أنواع مختلفة من<em> Imperata cylindrica</em> (cogongrass) التي لا يمكن تمييزها عن طريق التشكل وحدها. هذه الأصناف وتشمل الأعشاب الضارة الواردة اتحاديا، cogongrass وثيقة الصلة، واسعة الانتشار متنوعة الزينة، وأنا<em>. cylindrica</em> فار.<em> koenigii</em> (يابانية عشب الدم).
Abstract
Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica ‘Rubra’, Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.
Protocol
Discussion
الحضانة الولايات المتحدة والصناعات المشهد تزدهر على زراعة وبيع أنواع النباتات الغريبة ورواية. هذا، بالإضافة إلى تزايد عولمة التجارة، ويزيد من فرص أن الأنواع النباتية الغازية ستدخل، وإنشاء، وانتشرت في الولايات المتحدة القدرة على تنظيم الحكومة الفدرالية مثل هذه المصانع تعتمد على المعلومات التي غالبا ما تكون غير متوفرة، بما في ذلك القدرة على أن تصبح الغازية الصحيح والتصنيف، والطابع المميز وراثية من الأصناف المحلية والمتجنسين. لأن معرفتنا النباتات الغازية غالبا ما تكون محدودة، وقد تم النباتات المستوردة ذات الخصائص المخفية الغازية قدم عن طيب خاطر فقط لمعرفة وقت لاحق انهم غزو مواردنا الزراعية والطبيعية. هذا البروتوكول يهدف الى معالجة هذه المشاكل مرتبطة أولا أصناف cylindrica من خلال تقديم أول طريقة مبسطة الجزيئية التي يمكن أن نميز بدقة بين البرية من نوع cogongrass وشكل عادت من نظيره JBG الزينة.
jove_content "> وبالنسبة للتنمية من هذا البروتوكول، وجمعت من النوع البري cogongrass من السكان المجنسين في وحدة البركة الغابات كريك في مقاطعة سانتا روزا بالقرب جاي، فلوريدا في شهر يونيو من عام 2008. JBG تم شراؤها من المشاتل التجارية (بلوبيرد اطفال، المؤتمر الوطني العراقي ..) في يونيو 2008 وكذلك من جمع المنزل في كولومبيا، MO JBG يعود تم الحصول عليها من باحة متحف كامبل الجيولوجي في جامعة كليمسون، واتفاقية استكهولم في يونيو 2008؛ من جامعة بارك في ريفرديل، ماجستير في يونيو 2009، و من الساحة الأمامية من المنزل في كولومبيا، مو في عام 2009 (التي تم تحديدها من قبل Cseke ليلاند). تمت المحافظة على جميع النباتات في الدفيئة التي تقع في جامعة ألاباما في هانتسفيل (هانتسفيل، AL).وشملت التسلسل الجيني للحمض النووي التي تم جمعها من هذه النباتات ومقارنات في عمق 9 مناطق الحمض النووي المستقل الذي يستخدم عادة في محطات الباركود 2. في جميع الحالات، كانت تتابع JBG مباراة بنسبة 100٪ لتلك التي تعود JBG، مما يساعد علىتحقق من أن JBG لا تعود في الواقع إلى نموذج، أخضر الغازية. فقط لبرنامجها النووي وبلاستيدات الخضراء المناطق trnL-F خلافات التي يمكن استخدامها للتمييز بين وراثيا cogongrass وJBG. في منطقته لديها ما مجموعه 3 تعدد الأشكال (الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة) بين cogongrass وJBG، في حين ان المنطقة trnL-F قد 2 و 2 النيوكلوتايد InDels (الإدراج والحذف). هذه الاختلافات الوراثية سمح متنوعة محددة بادئات PCR إلى تطوير التي يمكن أن تميز بين من النوع البري cogongrass ويعود JBG. قد تأتي النتائج الأكثر موثوقية من الاشعال المستمدة من المنطقة trnL-F صانعة. وهكذا، ويستند هذا البروتوكول على الفوارق بين المناطق تسلسل trnL-F من الجينوم بلاستيدات الخضراء من cogongrass، JBG وعادت JBG (الشكل 4).
للمساعدة في توليد الاشعال التي هي أكثر تحديدا للأصناف المذكورة والمساعدة على تجنب ايجابيات كاذبة من أنواع وثيقة الصلة، آلل معروف trnL-F تسلسل أولا وتمت مقارنة مع أصناف cylindrica trnL-F متواليات من أنواع الأعشاب ذات الصلة (43 سلاسل مستقلة من 29 نوعا، على سبيل المثال، Cymbopogon citratus، Sorghastrum incompletum، دمع أيوب، jobi، Miscanthus سينينسيس، قصب السكر officinarum، halepense الذرة البيضاء). وعلى الرغم من أننا فحص متواليات التمهيدي متنوعة محددة عبر 29 نوعا من العشب، وخصوصية الاشعال تشكيلة معينة لم يتم دراستها على نحو شامل لقدرته على تضخيم الحمض النووي من معظم الأنواع الأخرى العشب. وبناء على ذلك، ينبغي أنسجة المستخدمة لاستخراج الحمض النووي التي تم تحديدها بعناية كما I. cylindrica قبل البدء في هذا البروتوكول. إذا لا يمكن تحديد العشب إما cogongrass أو JBG، ثم نقترح التسلسل للمنتج PCR للتأكد من أن تسلسل وتطابق تام إلى cogongrass أو JBG. حاليا، فإن الطريقة الأكثر دقة للتحقق من هوية من عينة عشب معين هو لأداء PCR في تي في على حد سواءrnL-F والمناطق، تليها سلسلة من المنتجات والتحقق PCR ومقارنة تسلسل إلى تسلسل معروف من الأنواع التي تم تحديدها بدقة. ويمكن تضخيم الحمض النووي باستخدام بادئات المراقبة المفصلة في هذا البروتوكول (لمنطقة trnL-F) أو الاشعال الأخرى التي تتوافر في غيرها من المنشورات 13-15. التسلسل هو عمل أكثر من ذلك بكثير وتكلفة مكثفة من استخدام إجراءات مبسطة لدينا.
نوعية الاشعال PCR تستخدم لأمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء. لقد جعلنا من الاشعال لهذا الإجراء المتاحة من شركة المائل، بيو ( http://www.obliquebio.com/web/ ، هانتسفيل، AL). ميزة ليأمر الاشعال من بيو المائل هي أنها تخزين أعداد كبيرة من aliquots من كل التمهيدي من سلسلة إنتاج نموذج مطابق كما الاشعال نحن تستخدم لتعظيم الاستفادة في مختبرنا. وبناء على ذلك، الاشعال ليس فقط تسلسل نفسه، ولكن تيمهلا تأتي من الكثير إنتاج نفسها بالضبط التي تم استخدامها في هذا البروتوكول. باستخدام بادئات من نفسه الكثير، يمكن أن تساعد على تجنب المتغيرات الدخيلة في الإجراء الذي قد ينجم عن الاختلاف في نوعية بادئات PCR. وعلى نحو مماثل، في حين الأخرى بلمرة طق ينبغي أن تعمل بشكل جيد لPCR، ونوعية بوليميريز طق المستخدمة لها تأثير على جودة نتائج PCR. للسماح لأفضل الاتساق في الكواشف PCR، ونحن الأمثل للبروتوكول باستخدام الكواشف من Clontech. وميزة 2 بوليميريز (Clontech، ماونتن فيو، كاليفورنيا، القط # 639201 أو 639202) هو خليط من قوية، بوليميريز طق الساخنة البداية وانزيم تصحيح التجارب المطبعية التي تساعد على تقديم نوعية عالية والتكبير أكثر دقة.
لأن هذا البروتوكول يعتمد على الحمض النووي بلاستيدات الخضراء، التي ورثت أمومي في الأعشاب، قد لا أحداث التهجين بين cogongrass والأنماط الجينية JBG يتم القبض مع إجراء لدينا تحديد الجزيئية. في الحالات التي يكون فيها الجسمى هو suspeالمديرية، ونحن نوصي باستخدام مناطق النووية التي ورثتها من الآباء والأمهات على حد سواء. الأكثر استخداما غير صانعة منطقة المتغير للنظر في التنميط الجيني للنبات هو النووي الريباسي ITS منطقة 13-15،17. حاليا، نحن نحرز تقدما نحو الإرسال المتعدد التضخيم من المنطقة trnL-F بلاستيدات الخضراء مع أن المنطقة النووي في أنبوب PCR نفسه. والإرسال المتعدد صانعة مع مناطق الحمض النووي الالتفاف المحتمل أن القيود المفروضة على استخدام إما وحدها، ولكن مثل هذه الأساليب تتطلب التحسين وتقييم إضافية لتحديد الجدوى الاقتصادية على أساس كل حالة على حدة. كما أن استخدام PCR في الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)، والتكنولوجيات الجديدة، مثل منارات الجزيئية (تحقيقات اولية فلوري)، كما يجري حاليا تقييم آمنة من الفشل ودقة أساليب التنميط الجيني للنبات.
بروتوكول المقدمة هنا يقدم نهجا سريعة وموثوق بها للتمييز بين JBG تعود من أن من البرية من نوع cogongrass. نحن نشجع استخدامالتمرير من هذا البروتوكول في الاتصال بنا للإبلاغ النتائج المستمدة من استخدام هذا البروتوكول. لا بل ان هذه المعلومات المشتركة تساعد على توفير معلومات عن توزيع JBG يعود. وسيساعد هذا أيضا المنظمين في وزارة الزراعة الأميركية من اتخاذ قرارات مستنيرة بشأن الإجراءات التي قد تكون في حاجة للالتفاف على انتشار والتهجين المحتملة للأصناف cogongrass الغازية للغاية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر آلان تاسكر (USDA-APHIS، ريفرديل، MD)، ستيفن كومبتون (كليمسون)، شيري Aultman (كليمسون) والويلزي كريغ رمزي (USDA-APHIS، فورت كولينز، أول أكسيد الكربون)، وبيتي Marose (الخفة) للحصول على المساعدة في الحصول على عينات . نشكر الطلاب أندرو ادريان (UA-هانتسفيل) وديريك ثاكر (UA-هانتسفيل) لمساعدتها في اختبار هذا البروتوكول، وHerdy جوزيف لعمله في تصوير الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الأسماك الوطنية ومؤسسة الحياة البرية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
Referenzen
- Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. . A Geographical Atlas of World Weeds. , (1979).
- CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , (2007).
- MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) – Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
- Talley, S. M., Cseke, L. J., Zink, R. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. , 27-28 (2009).
- Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -. K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
- Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
- Weber, E. . Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , (2003).
- Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
- Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
- Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
- Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
- Talley, S. M., Ramsey, C. L., Zink, R. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. , 29-30 (2009).
- Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
- Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
- Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
- Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
- Chou, C. -. H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).
