Imágenes de los receptores de estrógenos-α en ratas arteriolas Pial usando un microscopio de inmunofluorescencia Digital

Anteriormente, hemos demostrado que después de una lesión transitoria mundial cerebral isquémico de la arteria pial capacidad de cambio de diámetro en respuesta a los vasodilatadores ^{7, 8} y ⁹ vasoconstrictores es marcadamente deprimidos en los jóvenes ratas ovariectomizadas. Reposición de estrógeno crónica restaura las respuestas vasomotoras ^7-9. Además, el reemplazo de estrógeno retraso revierte los efectos beneficiosos de los estrógenos sobre la arteria pial capacidad vasodilatadora ¹⁰ que nos lleva a la pregunta de si a largo plazo el agotamiento de los estrógenos afecta a ER-α densidad en el cerebrovasculature. Se planificó utilizar el etiquetado de inmunofluorescencia en combinación con el Western Blot para evaluar los cambios en la ER-α expresión en respuesta al agotamiento del estrógeno crónica. Porque hemos tenido algunas dificultades en la visualización de los grupos discretos de receptores se modificó el método que se demuestra aquí. Por lo tanto, nuestro objetivo principal en este estudio fue desarrollar primero un método relativamente sencillo para optimizar la visualzación de los receptores en las arteriolas pial. De acuerdo con varios informes ^6,11,12 nos pareció que era necesario hacer ajustes para el tipo de tejido que estaban investigando, el espesor de la muestra, la distribución de ER-α en el buque, así como el grado de unión no específica .

Nuestro método es muy eficaz para visualizar la presencia de ER-α en rodajas barco pial. Sin embargo, como ya se ha señalado anteriormente el uso exitoso de estos métodos depende en gran medida la especificidad y la concentración de los anticuerpos, la localización subcelular de las proteínas de interés, la fijación y protocolos de bloqueo y la manipulación de tejidos ^12. Antes de la visualización de los preparativos nuestro barco pasamos tiempo para trabajar en todas estas variables. Hemos puesto de relieve la forma en que es necesario ajustar algunos de nuestro enfoque en este documento.

Nos pusimos en marcha para visualizar de forma óptima ER-α en las arteriolas piales y esto presenta algunos desafíos.En primer lugar, el tamaño promedio de una arteria de rata pial es entre 35 a 50 micras haciendo aislamiento y la eliminación de la superficie del cerebro un poco complicado. Encontramos que la perfusión con colorante azul de Evans antes de su sacrificio hace la disección de las arterias más fácil. Azul de Evans pueden afectar a la fluorescencia, pero creemos que la ventaja de utilizar este medio son mayores que sus inconvenientes menores. En nuestro protocolo de los vasos se lavan varias veces. Esto minimiza el tinte residual en los vasos sanguíneos y reduce los posibles efectos del colorante en la fluorescencia. Otra dificultad que encontramos fue que el espesor de los segmentos de buques pial hizo una visualización clara de los receptores difícil. Además, no hemos podido obtener imágenes muy clara, probablemente debido al hecho de que la ER-α se dispersó a lo largo de varias capas de células. Hemos intentado trabajar con las rebanadas de vasos longitudinales (como otros han hecho), pero debido al tamaño pequeño pial era difícil de manejar las embarcaciones y evitar la tortuosidad de los vasos durante el montajeen las diapositivas, incluso con un microscopio. Por último, hemos modificado nuestra técnica con éxito mediante el uso de un criostato y cortar el buque en sentido cruzado a ocho anillos de micras de espesor. Los anillos son más fáciles de manejar y varios se puede montar en una diapositiva.

Una vez que hemos adquirido los vasos creemos que es necesario poner a prueba la eficacia de la primer destello de la congelación de los tejidos a continuación se fijan los vasos según lo sugerido por Danseshatalb y asociados ^11. A pesar de que encontró un poco menos de inmunofluorescencia de fondo, también señaló que los receptores manchada con menor intensidad lo que la visualización de los receptores más difícil. En consecuencia, preferimos primero en congelar todo el cerebro y la tienda hasta que sea necesario (generalmente entre 1-2 meses). A continuación, salga de los vasos como se describe y arreglar los barcos antes de cortar con el criostato. como se demuestra aquí.

Un paso necesario es para ejecutar los controles tanto con la primaria y la secundaria de anticuerpos por separadopara determinar la especificidad y la inmunofluorescencia de fondo. El estrógeno α del receptor de anticuerpos pueden ser difíciles de trabajar. De hecho, hemos tratado tres diferentes anticuerpos primarios (1 monoclonales y policlonales 2) antes de que se mostraron satisfechos con el éxito de nuestra tinción de los receptores. Como parte de nuestros controles, primero verificar la especificidad del anticuerpo primario por omisión de la adición del anticuerpo primario. La figura 2D muestra el buque sin anticuerpo primario. No hay manchas y sólo una señal de poco fondo. Puesto que el anticuerpo primario es policlonal, hay una cierta difusa tinción no específica de fondo. En segundo lugar, añadió el anticuerpo primario, pero no el anticuerpo secundario (Fig. 2E). Se puede ver un buen margen en representación de la autofluoresence a lo largo de las fronteras del endotelio de los vasos. Esto es consistente con la obra de Dan y sus asociados ^5. Sin embargo, ni los pequeños puntos de inmunofluorescencia que representan ER-α, ni el árbitro aspecto granularlecting la presencia de numerosos receptores pueden ser detectadas sin la combinación de los anticuerpos primarios y secundarios. Hemos observado un patrón distinto de autofluoresence a lo largo de los márgenes del endotelio de los vasos. Estas pruebas independientes de la especificidad de anticuerpos son importantes ya que confirman la especificidad de los anticuerpos de ER-α y el anticuerpo secundario se une a la primaria.

En conclusión, como lo demuestran los otros ^{4, 5} vasos sanguíneos del cerebro contienen numerosos ER-α sub-tipo de receptores. En nuestras manos, preparando 8μm rebanadas de la sección transversal de las arterias aisladas pial mejora la coloración y la visualización de los receptores. Los métodos tradicionales de uso de la microscopía confocal para estudiar las muestras. Tener la capacidad para ver la serie de secciones ópticas a partir de muestras de espesor es un beneficio importante de la microscopía confocal. Sin embargo, la compra de un microscopio confocal bien puede ser muy costoso. Mediante el uso de gran profundidad (FED) de software, se encontró quepodría reducir nuestros costos de los equipos. Utilizando un microscopio de fluorescencia con EDF se obtuvieron imágenes claras y son capaces de visualizar pial arterial ER-α en varios niveles con Z-pilas. Una ventaja importante de los programas del FED es que permite la captura de imágenes de una manera efectiva para crear una imagen 3-D a partir de las imágenes. Para los laboratorios que no tienen acceso a un microscopio confocal o los fondos para una compra de un microscopio digital fluorescente con el software apropiado puede ser una opción práctica y menos costosa en función de los objetivos del investigador.