Actin cytoskeleton के लाइव Endothelial GFP-actin व्यक्त कक्ष में अध्ययन
Summary
GFP-actin व्यक्त रहते endothelial कोशिकाओं के सूक्ष्म इमेजिंग cytoskeletal संरचनाओं में गतिशील परिवर्तन के लक्षण वर्णन अनुमति देता है. तकनीक के विपरीत है कि निर्धारित नमूनों का उपयोग, इस विधि पहले ही कोशिकाओं में actin cytoskeleton में अस्थायी परिवर्तन की एक विस्तृत मूल्यांकन के दौरान, और विभिन्न शारीरिक, औषधीय, या भड़काऊ उत्तेजनाओं के बाद प्रदान करता है.
Abstract
The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5.
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-β-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration.
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.
Protocol
1. GFP-actin HUVEC के साथ अभिकर्मक विभिन्न तरीकों के लिए HUVEC transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला का उपयोग करता है Nucleofector प्रणाली (Lonza, बेसल स्विटज़रलैंड) के नीचे उल्लिखित है. सामान्य में, जल्दी से काम करने के लिए सेल व्यवहार्यता और अभिकर्मक दक्षता में सुधार. प्रत्येक अभिकर्मक 5 x 10 5 HUVEC है कि दो गिलास coverslips (Corning है नंबर 1, 22 x 50 मिमी) पर वरीयता प्राप्त हो जाएगा की आवश्यकता है. Nucleofector प्लास्मिड डीएनए transfect electroporation और रासायनिक अभिकर्मकों को जोड़ती है, और आम तौर पर एक> 50% अभिव्यक्ति दक्षता प्राप्त है. रासायनिक अभिकर्मक अभिकर्मकों एक वैकल्पिक तरीका है. एक समूह को सफलतापूर्वक GFP-actin के साथ गोजातीय endothelial कोशिकाओं GenePORTER 6 अभिकर्मक का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट है . Nucleofector प्रोटोकॉल का उपयोग हम नीचे वर्णित है. Presterilized cultureware या साधारण coverslips कक्ष प्रकार के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. कांच coverslips के लिए, एक 10 सेमी संस्कृति थाली में उन्हें रखने के द्वारा एक जैविक सुरक्षा हुड में बाँझलगभग 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के 5 मिलीलीटर से युक्त. उन्हें एक अलग संस्कृति की थाली की ओर के खिलाफ झुकाव द्वारा बाँझ संदंश और शुष्क हवा के साथ उन्हें उठाओ. एक बार सूखा, अपने स्वयं के 10 सेमी संस्कृति की थाली में हर coverslip जगह. पिपेट coverslip के केंद्र पर एक 300 μL गर्म जेलाटीन समाधान के मनका (0.9% NaCl में 1.5%) और 5 मिनट के लिए खड़े करने के लिए, और फिर महाप्राण (व्यंजन) की अनुमति है. किनारों को छू के बिना केंद्र में इस मैट्रिक्स कोटिंग, रखते हुए यह सुनिश्चित है कि कोशिकाओं वरीयता प्राप्त घनी हो जाएगा और संगम जल्दी हासिल होगा. अभिकर्मक प्रति EGM2MV मीडिया (Lonza) की 500 μL के साथ एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में अलग सेट तैयार . HUVEC 0.25% trypsin – EDTA के साथ अलग और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा. कोशिकाओं की गणना. 5 x 10 5 कोशिकाओं प्रत्येक अभिकर्मक के लिए आवश्यक हैं. सेल निलंबन मात्रा समायोजित करने के लिए एक गोली है कि 5 x 10 5 transfe की संख्या से गुणा कोशिकाओं में शामिल होंगे प्राप्तctions प्रदर्शन किया. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 5000 rpm पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. झुकने ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) के लिए जितना संभव हो उतना मीडिया हटायें. गोली या तो HUVEC या प्राथमिक Endothelial सेल Nucleofector किट (Lonza) से मूल Nucleofector समाधान के साथ Resuspend. 5 x 10 5 कोशिकाओं प्रति 100 μL का प्रयोग करें. इस समाधान की विषाक्तता के कारण, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए जल्दी से काम करते हुए कोशिकाओं को इस समाधान में निलंबित कर रहे हैं. अभिकर्मक नमूना GFP-β-actin प्लाज्मिड सदिश (Nucleofector निलंबन के 100 μL प्रति 0.2-2 μg) जोड़ें. GFP-actin 5 x 10 अभिकर्मक 5 प्रति कोशिकाओं के प्रति प्लास्मिड डीएनए के 0.2-2 μg . एक Nucleofector क्युवेट सेल निलंबन के 100 μL स्थानांतरण. कवर और नल क्युवेट सेल निलंबन को सुनिश्चित करने के लिए समय की कुछ तह तक सभी तरह है. Nucleofector द्वितीय डिवाइस क्युवेट स्लॉट में क्युवेट प्लेस और चलाने घesired electroporation कार्यक्रम. हम HUVEC के लिए एक 034 – प्रोग्राम का उपयोग करें. जैविक सुरक्षा हुड के लिए क्युवेट लौटें. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर कि हुड के लिए EGM2MV के 500 μL शामिल से microfuge ट्यूब लाओ. एक हस्तांतरण Nucleofector किट में प्रदान pipettes के प्रयोग, धीरे क्युवेट में सेल निलंबन के लिए मीडिया के गर्म 500 μL जोड़ने. Microfuge ट्यूब और इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए जगह क्युवेट वापस की सामग्री के सभी स्थानांतरण. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. दोहराएँ 9-11 कदम के रूप में की जरूरत है अगर अधिक कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट हो रहे हैं. एक microfuge ट्रांसफ़ेक्ट HUVEC निलंबन के 600 μL युक्त ट्यूब दो coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. हुड के अंतर्गत है और एक 1000 μL micropipette के साथ, धीरे से ऊपर विंदुक और नीचे एक बार निलंबन का मिश्रण है, और तब जिलेटिन में लिपटे coverslip पर सीधे निलंबन की 300 μL जगह. निलंबन coverslip की बढ़त स्पर्श मत करो. ° सी / 5% सीओ 2 37 में स्थान </sयूबी> इनक्यूबेटर 1-4 घंटे के लिए सेल लगाव के लिए अनुमति देने के लिए. 1-4 घंटे के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए की पुष्टि के लिए वे coverslip करने के लिए संलग्न है. फिर EGM2MV मीडिया के 10 एमएल जोड़ने के लिए, और थाली को 37 ° सी / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर. GFP-actin अभिव्यक्ति आम तौर पर 4-8 घंटे के भीतर देखा जा सकता है है. प्रयोगों आमतौर पर 24-48 एच. के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं 2. जीना सेल इमेजिंग कक्ष की स्थापना और मंच हीटर हमारे अध्ययन से ज्यादातर के लिए, हम एक वार्नर उपकरण खुला हीरा (RC22) स्नान एक PH-1 चरण हीटर में रखा है, एक गुरुत्व प्रवाह प्रणाली द्वारा खिलाया इस्तेमाल किया है. हालांकि, कई विकल्प रहते हैं कि कक्षों गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन, खुला बनाम बंद कक्षों, और विभिन्न microincubator / उद्देश्य हीटर संयोजन और बड़े इनक्यूबेटर सिस्टम को समायोजित सहित सेल इमेजिंग चरणों, के लिए उपलब्ध हैं. अंत में, कक्ष चयन सहित कारकों स्नान का उपयोग करने के लिए एक परीक्षण एजेंट या दवा जोड़ने की जरूरत है, whe पर निर्भर करेगामध्यम स्थिर या प्रवाह के अंतर्गत हो सकता है, और प्रयोग की लंबाई. इसके अलावा, कभी कभी तापमान अस्थिरता जैसे कारकों को ध्यान केंद्रित बहाव के कारण, और नियंत्रण प्रणाली है कि स्थिर स्नान और उद्देश्य के तापमान को बनाए रखने कर सकते हैं के द्वारा कर सकते हैं कम से कम किया जा सकता है. अशेष भाजक प्रयोग के लिए पर्याप्त माध्यम. Albumin शारीरिक नमक समाधान के विभाज्य हम 50 मिलीलीटर (APSS, तालिका 1) प्रत्येक घंटे के लिए प्रयोग पिछले जाएगा. या तो एक पंप या गुरुत्वाकर्षण प्रवाह प्रणाली कक्ष के माध्यम देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रणाली के लिए, हम एक साधारण गुरुत्वाकर्षण प्रवाह एक अंतःशिरा प्रवाह लाइन, एक इनलाइन हीटर (वार्नर उपकरण मॉडल एसएच 27A) से जुड़ा से बनाया प्रणाली के लिए APSS जोड़ने. हम लगभग 40 एमएल / एच. में प्रवाह लागू यदि हमारे जैसे एक खुला स्नान कक्ष इस्तेमाल किया जाएगा, हीरा स्नान के underside पर और एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ बाहरी किनारे करने के लिए वैक्यूम तेल लागू. अगला, हम इनक्यूबेटर से एक coverslip सेल कवर मिलता है, और धीरे संदंश का उपयोग coverslip लिफ्ट. Gently एक kimwipe पीठ को छूने के लिए अतिरिक्त मध्यम सोख पक्ष सेल कवर गीला रखते हुए. के साथ कोशिकाओं के ऊपर चेहरा, coverslip पर हीरे स्नान जगह एक कक्ष फार्म. जल्दी चरण हीटर में चैम्बर जगह और चैम्बर से अधिक clamps का हाथ कस. इस स्तर पर एक प्रमुख चिंता का विषय है संभावना है कि कोशिकाओं को बाहर सूख जाएगा. इसलिए यह महत्वपूर्ण है को जल्दी से काम करते हैं और जब किया, तुरंत विंदुक ~ कक्ष में 1 मध्यम एमएल बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए. हमारी कक्ष कोशिकाओं पर मध्यम के सतत प्रवाह के लिए अनुमति देता है. बस प्रवाह पर बदल से पहले, यह महत्वपूर्ण कक्ष पर अपनी धारक को एक वैक्यूम नली संलग्न करने के लिए अतिरिक्त मध्यम संस्कृति (APSS) के बाहर निकलने की अनुमति है. इनलाइन हीटर और स्नान हीटर भी एक बिंदु (37 डिग्री सेल्सियस) पर दिया जाना चाहिए. हमारी प्रणाली भी एक thermistor तापमान की निगरानी जांच, जो स्नान के किनारे पर रखा जाना चाहिए है. ध्यान सह के नीचे पोंछएक 70% EtOH से लथपथ शेष EGM2MV मीडिया और नमक buildup को दूर kimwipe के साथ verslip. एक सूखी kimwipe या लेंस कागज के साथ एक दूसरी बार साफ कर लें. बाद चैम्बर गठन किया गया है, प्रवाह पर है, और तापमान 37 पर स्थिर है ° सी, कम से कम 30 मिनट की कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए और प्रयोग शुरू करने से पहले स्थिर की अनुमति. जबकि इंतज़ार कर रही है, रहने कक्ष इमेजिंग खुर्दबीन (दीपक, फिल्टर पहिया नियंत्रक, कैमरा, कंप्यूटर) के सभी घटकों पर बारी. 3. रहने कक्ष इमेजिंग खुर्दबीन के साथ डेटा का अधिग्रहण विभिन्न जीवित सेल माइक्रोस्कोपी प्रणाली उपलब्ध हैं. हमारी प्रणाली निम्नलिखित घटकों के साथ एक Nikon ते 2000U ग्रहण है: Sutter उपकरण Lambda रास 300 डब्ल्यू क्सीनन दीपक उपकरण Sutter Lambda SmartShutter S492 और फिल्टर के साथ 10-3 उत्तेजना फिल्टर पहिया (D350 और S572 उत्तेजक फिल्टर यूवी और आरएफपी अनुप्रयोगों के लिए भी उपलब्ध हैं) Dichroic 2002bs emitter (61 Nikon002m) CI योजना Fluor 10X DLL के उद्देश्य, NA 0.30 (Nikon MRH10100) योजना Fluor ELWD 40x डीएम उद्देश्य, 0.60 एनए (MRH08420 Nikon) योजना ए पी ओ कुलपति 100X तेल उद्देश्य, एनए 1.40 (MRD01901 Nikon) Photometrics CoolSNAP HQ2 कैमरा, 1392 x 1040 इमेजिंग सरणी, 6.45 x 6.45 सुक्ष्ममापी पिक्सल (नट वैज्ञानिक) हम भी दो सॉफ्टवेयर संकुल है कि छवि के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Nikon तत्वों ए.आर. 3.0, और 6.1 Metamorph. कोशिकाओं को देखने और अध्ययन के लिए एक उपयुक्त क्षेत्र खोजने के बाद, मोटे ध्यान केंद्रित घुंडी ताला और इतना है कि सॉफ्टवेयर अधिग्रहण सेटिंग्स की जाँच करें: फिल्टर पहिया S492 फ़िल्टर (लेबल हमारे विन्यास में "FITC") के लिए सेट कर दिया जाता है अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, उद्देश्य के लिए इच्छित आवर्धन (हमारे खुर्दबीन motorized नहीं है, लेकिन यह सुक्ष्ममापी / पिक्सेल अनुपात सेट) से मेल करने के लिए सेट कर दिया जाता है. यह भी यकीन है कि खुर्दबीन पर optivar लेंस 1.0X आवर्धन करने के लिए सेट कर दिया जाता है. Optiv स्थापना1.5x के लिए गिरफ्तारी बढ़ाई बढ़ाने के लिए, लेकिन हो सकता संकेत तीव्रता को खोने की कीमत पर. के लिए इस्तेमाल किया जा बढ़ाई अध्ययन के उद्देश्य निर्भर करता है. विस्तार के लिए सबसे अच्छा है, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 100X उद्देश्य सबसे अच्छा स्थानिक संकल्प और संकेत के संचरण प्रदान करेगा. हमारी माइक्रोस्कोप भी एक लंबे समय तक काम दूरी 40x एक अलग अनुप्रयोग है कि अतिरिक्त दूरी की आवश्यकता के लिए इरादा उद्देश्य के साथ सुसज्जित है. हालांकि, इस उद्देश्य उपयोगी हो सकता है जब हम एक साथ कई कोशिकाओं निरीक्षण करना चाहते हैं, कर सकते हैं और organelle आकार की संरचनाओं को देखने के लिए ठीक काम करता है, लेकिन स्थानिक संकल्प और संकेत तीव्रता को खोने की एक कीमत पर. किसी भी अध्ययन है जिसमें संकेत तीव्रता एक endpoint है, या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जैसे और अधिक उन्नत इमेजिंग तकनीक के लिए धब्बा है, एक 100X उद्देश्य की सिफारिश की है. कैमरा जोखिम समय एस 0.5-2 के बीच सेट कर दिया जाता है यह GFP-actin कोशिकाओं में तीव्रता पर निर्भर करता है. हम आम तौर पर सबसे कम संभव समय जोखिम का उपयोग करने के लिए बीएल बचने केGFP actin और कोशिकाओं को संभावित विषाक्तता eaching. सबसे अच्छा समाधान प्राप्त करने के लिए, Binning 1 x 1 पर सेट किया जाना चाहिए और 1 पर लाभ. कुछ मामलों में हम 2 से binning x 2 निर्धारित किया है समय जोखिम को कम करने, लेकिन यह हम समय चूक अध्ययन में चलती वस्तुओं पर कर सकते हैं माप की शुद्धता को कम कर देता है. समय चूक सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करें: फ़ोल्डर चुनें करने के लिए कब्जा कर लिया छवियों को बचाने के लिए और एक फ़ाइल नाम लिखें. प्रयोग के लिए और छवियों इंटरवल अवधि समय की संख्या निर्धारित करें. हम आम तौर पर छवियों और अप करने के लिए 2 घंटे की अवधि के लिए के बीच 15 एस के लिए एक मिनट के अंतराल का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि सक्रिय शटर अधिग्रहण के बीच बंद होना तय है. इससे पहले कि समय चूक छवि अधिग्रहण शुरू, बंद कमरे की रोशनी बारी और एक एकल छवि पर कब्जा करने के लिए सेटिंग्स की जाँच. इसके अलावा एक brightfield छवि पर कब्जा. सुनिश्चित करें कि संघनित्र उचित चरण या डीआईसी फिल्टर करने के लिए सेट कर दिया जाता है. चालू करेंहलोजन दीपक और छवि एकत्र. हलोजन दीपक बंद करें. समय चूक इमेजिंग के लिए "FITC" सेटिंग्स पर वापिस और एक परीक्षण छवि पर कब्जा. समय चूक श्रृंखला कैप्चर. प्रयोग के दौरान, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए छवियों की निगरानी के रूप में वे प्राप्त कर रहे हैं. कुछ उदाहरणों में चैम्बर के भीतर तापमान में छोटे परिवर्तन को ध्यान बहाव के कारण हो सकता है. यह प्रवाह और वैक्यूम लाइनों का अनुकूलन इतना है कि प्रवाह कोशिकाओं से अधिक स्थिर है से बचा जा सकता है. इसके अलावा, खुर्दबीन कमरे में यातायात कम से कम, और छत हवा vents से ड्राफ्ट खुर्दबीन से दूर पुनर्निर्देशित सहायक हो सकता है. एक विकल्प है कि अच्छी तरह से हमारे अनुभव में काम किया है का उपयोग 37 ° सी / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर कक्षों है कि पूरे मंच और उद्देश्य संलग्न है. ये प्रस्ताव निगरानी रातोंरात या अब कोशिकाओं के लाभ, लेकिन कोशिकाओं के लिए उपयोग सीमित है. यदि आवश्यक हो, समय चूक अधिग्रहण थामने और छवि refocus. जितना जल्दी संभव हो refocus प्रदर्शन छवियों के बीच समय अंतराल में फेरबदल करने से बचें. एक ठेठ प्रोटोकॉल आधारभूत छवियों के 20-30 मिनट के एक परीक्षण के अतिरिक्त छवि अधिग्रहण का 0.5 से 4 घंटे के द्वारा पीछा एजेंट को जोड़ने से पहले शामिल होंगे. प्रयोग की लंबाई पर समय है, जो कि क्यों यह महत्वपूर्ण है के लिए कम से कम जोखिम समय संभव चुन GFP के photobleaching द्वारा सीमित किया जा सकता है. यह भी 30-60 s से समय व्यतीत हो छवियों के बीच के अंतराल को बदलने अगर वांछित एक लंबे समय तक अध्ययन है वांछनीय हो सकता है. 4. डेटा विश्लेषण कई सॉफ्टवेयर संकुल के लिए एनआईएस तत्वों, Metamorph, Slidebook, आदि जैसे छवि सेट, विश्लेषण हम आम तौर पर हमारी छवि विश्लेषण का उपयोग एनआईएच ImageJ हमारी प्रयोगशाला पर या घर पर किसी भी कंप्यूटर पर विश्लेषण सक्षम करने प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संस्करणों हम प्रयोग कर रहे हैं: MBF ImageJ ( http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ ) फिजी ("लक्ष्य =" मैं "_blank http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji>). ImageJ सहित कई गतिशील प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: Lamellipodia protrusions की आवृत्ति दूरी, समय, और protrusions के वेग समय पर actin फाइबर आंदोलन Nikon तत्वों एक "एनडी" फ़ाइल के रूप में समय चूक छवियों बचाता है. ImageJ में खुला यह एक TIF श्रृंखला "निर्यात ND दस्तावेज़" सुविधा का उपयोग करने के लिए परिवर्तित किया जा जरूरत है. Metamorph छवि ढेर ImageJ में संशोधन के बिना खोला जा सकता है. एक विकल्प हम चुनते हैं जब ImageJ में एक TIF श्रृंखला खोलने के लिए 8 बिट कन्वर्ट करने के लिए स्केल है. यह देखने आसान बनाता है क्योंकि चमक और विपरीत समायोजन पूरे बजाय एकल छवि देखा जा रहा श्रृंखला के लिए लागू होगी. ImageJ में, विंडो के ऊपरी बाएँ कोने में हो सकता है जब छवि सेट टुकड़ा संख्या / कुल स्लाइस को खोलता है प्रदर्शित किया जाएगा, फ़ाइल नाम के साथ साथ, पिक्सेल, फ़ाइल प्रकार, और आकार की संख्या. जेड नीचे पर स्क्रॉलबार समय मेल खाती है. इसके अलावा, छवि पर सूचक मँडरा एक्स, वाई, और z ImageJ उपकरण पट्टी के नीचे पिक्सेल स्थान पर प्रदर्शित करेगा. Lamellipodia फलाव समय पर नई protrusions के संख्या का निर्धारण करने के द्वारा अध्ययन किया जा सकता है. इस पूरे सेल परिधि या एक चयनित क्षेत्र के लिए किया जा सकता है है. विश्लेषण के इस प्रकार भी चरण विपरीत या डीआईसी माइक्रोस्कोपी के साथ nonconfluent, untransfected कोशिकाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है. हालांकि, GFP-actin व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग सहधारा monolayers के विश्लेषण की अनुमति देता है, खासकर जब युक्त कोशिकाओं और GFP-actin कमी एक दूसरे से सटे हैं. Lamellipodia फलाव दूरी, हठ (समय), और वेग kymograph विश्लेषण (स्कैन लाइन) के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. (यह आसान है अगर वहाँ कोई आसन्न सेल, या आसन्न सेल GFP-actin व्यक्त नहीं करता है) एक सेल के किनारे करने के लिए एक लाइन सीधा ड्रा. ImageJ में "/" दबाने x-अक्ष घ प्रतिनिधित्व के साथ एक kymograph उत्पन्न होगाistance और y-अक्ष का प्रतिनिधित्व (15 पिक्सेल प्रति 1 मिनट के लिए समय अंतराल उपरोक्त निर्देशों के अनुसार). लाइन्स एक उभड़नेवाला lamellipodia और बॉक्स आयाम मापा (ImageJ में एम दबाकर) पर खींचा जा सकता है है. दूरी, समय, और वेग तो गणना की जा सकती है. तनाव फाइबर का आंदोलन भी इसी तरह फैशन में kymograph विश्लेषण द्वारा मापा जा सकता है है. 5. प्रतिनिधि परिणाम: हमारे अभिकर्मक प्रोटोकॉल के साथ, हम आम तौर पर कम से कम 50% ट्रांसफ़ेक्ट HUVEC में GFP-actin की अभिव्यक्ति देखते हैं, और अक्सर coverslip पर क्षेत्रों पा सकते हैं जहां> व्यक्त GFP-actin क्षेत्र में HUVEC के 90%. Subconfluent HUVEC व्यक्त GFP-actin के साथ एक जीवित कोशिका इमेजिंग प्रयोग के एक उदाहरण 1 मूवी में दिखाया गया है. इस विशेष प्रयोग के लिए, एक छवि एक बार प्रति मिनट अधिग्रहण कर लिया था. है के रूप में फिल्म, GFP-actin में HUVEC में देखा जा सकता है cytoplasm भर में मनाया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में filamentous struct मेंures और स्थानीय lamellipodia में सेल बढ़त के साथ उभड़नेवाला. इसके अलावा फिल्म में स्पष्ट है कि GFP-actin अभिव्यक्ति की कोशिकाओं के बीच एक समान नहीं है. अध्ययन के लिए चुना कक्ष आमतौर पर पर्याप्त GFP-actin के लिए विभिन्न संरचनाओं filamentous actin युक्त कल्पना मौजूद है. GFP-actin के बहुत उच्च स्तर व्यक्त कोशिकाओं के अध्ययन के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि इन कोशिकाओं में यह आम तौर पर मुश्किल होता है जी actin वर्तमान की उच्च राशि से एफ actin संरचनाओं भेद कर सकते हैं. 2 मूवी सहधारा HUVEC व्यक्त GFP-actin के व्यवहार का एक उदाहरण से पता चलता है. Subconflent HUVEC की तरह, सक्रिय lamellipodia गठन और कोशिकाओं के perimeters साथ कारोबार स्पष्ट किया गया था. हालांकि, इन lamellipodia अक्सर झमेलें झिल्ली को जन्म दिया है, कम कुशल 7 फलाव का संकेत है. शायद यह है कि आसन्न पास बुनियाद अवरुद्ध कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से है. Actin cortical फाइबर और तनाव फाइबर भी सिनेमा 1 और 2 में दिखाई दे रहे हैं. हालांकि कोशिकाओं हम ओbserved स्थिर बने रहे, तनाव फाइबर पलायन कोशिकाओं में अनुप्रस्थ चाप फाइबर के लिए इसी तरह की हैं, सेल के किनारे के पास निर्मित करना और सेल केंद्र है, जहां वे 8 जुदा, 9 की ओर laterally चलती. एक अतिरिक्त गतिशील इन कोशिकाओं में मनाया सुविधा है कि समकेंद्रिकतापूर्वक विस्तार, पहले नाम actin 10 बादलों actin अंगूठी संरचनाओं के गठन किया गया था . कैसे इन छवि समय चूक से दूरी, हठ, सेल protrusions के वेग और मात्रा रहे हैं का एक उदाहरण सेट kymograph विश्लेषण का उपयोग चित्र 1 में दिखाया गया है. चित्रा 1A में एक एकल पिक्सेल लाइन लगभग सीधा kymograph की पीढ़ी (चित्रा 1 बी) के लिए सेल के किनारे करने के लिए तैयार है. इस kymograph लाइन द्वारा परिभाषित क्षेत्र खड़ी रखा है और समय चूक भर से छवियों को क्षैतिज खड़ी दिखती हैं. बाएँ से kymograph में सही करने के लिए देख रहे हैं, protrusions सेल के किनारे में ऊपर की ओर आंदोलनों के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. चित्रा 1C में, एक लाइन का समर्थन किया गया थाइन protrusions के किनारे पर erimposed, और उस लाइन के साथ जुड़े पिक्सेल डेटा एकत्र थे और पैनल के नीचे परिणाम विंडो में दिखाए जाते हैं. इस विश्लेषण फलाव गतिशीलता की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, और भी सेल के इस क्षेत्र में फलाव आवृत्ति (protrusions / समय की संख्या) का अनुमान किया जा सकता है. तनाव फाइबर आंदोलन के विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. सबसे तनाव फाइबर हम सेल परिधि के पास गठन मनाया और सेल केंद्र की ओर चले गए, जहां वे अंततः disassembled. यह भी kymograph विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. एक लाइन सीधा सेल किनारे करने के लिए और तनाव (2A चित्रा) फाइबर और एक kymograph (चित्रा 2B) उत्पन्न होता है के लिए तैयार है. तनाव फाइबर kymograph में cytoplasmic क्षेत्र में निरंतर लाइनों, अक्सर नीचे जाने और सही (सेल केंद्र की ओर) के रूप में दिखाई देते हैं. कभी कभी फाइबर के मूल kymograph में देखने के लिए कठिन हैं, और हम इन मामलों मेंunsharp मुखौटा फ़िल्टर का उपयोग करने के लिए छवि (चित्रा 2C) पैनापन. लाइन्स तनाव फाइबर पर तैयार कर रहे हैं और पिक्सेल उपाय समारोह (चित्रा 2 डी) का उपयोग कर डेटा एकत्र कर रहे हैं. इस डेटा इकट्ठा करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका शुरू से ही एक रेखा खींचने के लिए पहचान तनाव फाइबर के समाप्त करने के लिए कि फाइबर (चित्रा 2 ई) मनाया गया अवधि के लिए औसत ढलान है. इस विश्लेषण तनाव फाइबर पार्श्व आंदोलन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है और भी तनाव सेल के इस क्षेत्र में मनाया फाइबर की संख्या यों इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1 सेल के किनारे Kymograph विश्लेषण फलाव दूरी, हठ, और स्थानीय lamellipodia के वेग का निर्धारण करने के लिए एक. एक एकल पिक्सेल लाइन लगभग सीधा सेल के किनारे करने के लिए तैयार है. इस क्षेत्र में समय चूक की प्रत्येक छवि के लिए समय के साथ क्षेत्र के एक असेंबल उत्पन्न सेट से निकाला जाता है बी . वें मेंkymograph परिणामस्वरूप ई, x-अक्ष समय का प्रतिनिधित्व करता है, बाएं से दाएं चलती और y-अक्ष की दूरी से पता चलता है. इस kymograph में समय पर सेल बढ़त के आंदोलन का मूल्यांकन किया जा सकता है, और lamellipodia क्षेत्रों में जहां सेल बढ़त, दाहिनी ओर चलती है, ऊपर की ओर चला जाता है की पहचान कर रहे हैं सी. सेल किनारे जहां एक lamellipodium द्वारा फलाव की पहचान की गई है पर एक लाइन तैयार की है. रेखा के लिए bounding आयत के आयाम तो अर्जित कर रहे हैं (आरोपित विंडो में दिखाया गया है). चौड़ाई फलाव समय या हठ की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊंचाई फलाव दूरी की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फलाव वेग चौड़ाई द्वारा ऊंचाई विभाजित करके गणना की है. इस उदाहरण में, ऊपर की ओर दूरी x 96 0.१६,१२५ सुक्ष्ममापी / पिक्सेल = 15.5 सुक्ष्ममापी पिक्सल था, और समय 11 पिक्सल x 1 / पिक्सेल मिनट = 11 यूके था. वेग 15.5 μm/11 मिनट के रूप में गणना की गई. = 1.4 सुक्ष्ममापी / मिनट. एफigure 2. actin तनाव फाइबर के आंदोलन के Kymograph विश्लेषण. एक एकल पिक्सेल लाइन सीधा सेल के किनारे करने के लिए तैयार है एक kymograph उत्पन्न बी. जैसा छवि में दिखाया गया है. 1, जिसके परिणामस्वरूप kymograph में, x-अक्ष समय और दूरी y-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है. तनाव फाइबर कक्ष में निरंतर लाइनों, अक्सर नीचे जा के रूप में और सही (तीर) सी के लिए मनाया जाता है. बेहतर तनाव फाइबर कल्पना, unsharp मुखौटा फिल्टर इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उदाहरण में, 3 पिक्सल और 0.60 के मुखौटा वजन के एक त्रिज्या इस्तेमाल किया था. डी. एकल पिक्सेल लाइनों तो पहचान तनाव फाइबर पर तैयार कर रहे हैं, और डाटा एकत्र. इस पैनल में तीन लाइनों और तैयार थे और फिर "हटाएँ" प्रत्येक माप के बाद उनके स्थान का एक स्थायी एनोटेशन (सफेद लाइन) बनाने दबाया था ई . वैकल्पिक रूप से, अगर तनाव फाइबर की औसत दूरी, समय, और वेग वांछित है, तो एक लाइन शुरू और खत्म अंक (पीले लाइन) से तैयार किया जा सकता है, और डेटा के लिएआर (परिणाम विंडो में डाला) प्राप्त किया जा सकता है. इस उदाहरण के लिए, माप 37 फ्रेम के लिए इस तनाव फाइबर x 1 / फ्रेम मिनट पर किए गए थे. = 37 मिनट. इस समय अवधि था 75 फ्रेम x 0.१६,१२५ सुक्ष्ममापी / पिक्सेल = 12.1 सुक्ष्ममापी अधिक दूरी कूच. जिसके परिणामस्वरूप तनाव फाइबर के पार्श्व वेग 12.1 μm/37min 0.33 = सुक्ष्ममापी / मिनट था. वेग के लिए एक सकारात्मक मूल्य सेल केंद्र, परिधि की ओर बढ़ फाइबर के लिए और नकारात्मक की ओर बढ़ फाइबर के लिए सौंपा है. रहते HUVEC का एक समय चूक मूवी छवियों को व्यक्त GFP-actin . छवियों के बीच के अंतराल 1 मिनट है. स्थानीय lamellipodia कक्षों की संपूर्ण परिधि साथ protruded. इसके अलावा, laterally अनुप्रस्थ चाप तनाव फाइबर कोशिकाओं के केंद्र की ओर चले गए. जब थ्रोम्बिन (1 यू / एमएल) स्नान करने के लिए जोड़ा गया है, कोशिकाओं अनुबंध थोड़ा और lamellipodia जावक protrusions के बारे में 10 मिनट के लिए रोके गए. बाद कोशिकाओं अनुबंध, lamellipodia गठन और कारोबार फिर से शुरू मृ यहाँ फिल्म देखने के लिए क्लिक करें. 2 मूवी सहधारा GFP-actin थ्रोम्बिन के साथ इलाज से पहले और बाद में, व्यक्त HUVEC. सेकंड: बीतासमय मिनट के रूप में नीचे दायें कोने में में दिखाया गया है. छवियों के बीच के अंतराल 30 एस थ्रोम्बिन (1 यू / एमएल) 45 मिनट के बाद जोड़ा गया है. आधारभूत अवधि. Actin बादलों (तीर, 1:59 – 21:29), और एक tricellular जंक्शन पर एक अंतर है कि चौड़ी बाद थ्रोम्बिन जोड़ा जाता है – एनोटेट घटनाओं स्थानीय lamellipodia गठन और कारोबार (37:29 सेल किनारों के पास arrowheads, 00:59) शामिल (तीर, 62:30 – 70:00). ट्रांसवर्स चाप तनाव फाइबर कोशिकाओं के कई में भी स्पष्ट कर रहे हैं. कोशिकाओं को सक्रिय गठन और उनके perimeters साथ स्थानीय lamellipodia के कारोबार के साथ कई झिल्ली को जन्म देने के झमेलें, का प्रदर्शन किया. थ्रोम्बिन lamellipodia गठन और कारोबार में एक ठहराव के कारण होता है, और कोशिकाओं के बीच कुछ छोटे अंतराल के संक्षिप्त रूप है.http://www.jove.com/files/ftp_upload/3187/Movie2-confluentHUVEC.avi "> फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
जीना endothelial कोशिकाओं में GFP-actin की इमेजिंग भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में actin cytoskeleton की गतिशीलता का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. यह विधि भी पिछले कतरनी 11 तनाव की तरह भौतिक बलों के जवाब में cytoskeleton की remodeling दिखा निष्कर्षों पर निर्माण के लिए उपयोगी हो सकता है. इसके अलावा, इस पद्धति actin cytoskeletal गतिशीलता का प्रवास, पिंजरे का बँटवारा, कहनेवाला जंक्शनों और junctional परिपक्वता के गठन, और बाधा समारोह के रखरखाव सहित विभिन्न endothelial सेल गतिविधियों, के लिए अपने योगदान की एक विस्तृत मूल्यांकन की अनुमति देता है.
दिखाया डेटा में, endothelial actin cytoskeleton के व्यवहार थ्रोम्बिन के साथ इलाज से पहले और बाद में देखा जा सकता है. Endothelial कोशिकाओं के किनारों के साथ सभी स्थानीय lamellipodia बनाने और दोनों nonconfluent और सहधारा सेल monolayers में समय पर regressing मनाया गया. थ्रोम्बिन के साथ उपचार संक्षिप्त lamellipodia फार्म बाधितव्यावहारिक और कारोबार. थ्रोम्बिन भी कोशिकाओं थोड़ा अनुबंध पिछली रिपोर्टों है कि थ्रोम्बिन actin तनाव फाइबर और endothelial 12-14 कोशिकाओं में वृद्धि की केन्द्राभिमुख तनाव के विकास के गठन का कारण बनता है के साथ समझौते में, के कारण होता है. हालांकि, इस तरह के रूप में जीना सेल इमेजिंग अध्ययन से, तनाव फाइबर के मूल अब निर्धारित किया जा सकता है. HUVEC में तनाव फाइबर के अधिकांश सेल परिधि में उत्पन्न और कोशिकाओं 8, 9 के पलायन में अनुप्रस्थ चाप फाइबर सदृश . तय कोशिकाओं का उपयोग करने पर इस पद्धति का एक और ताकत है कि तनाव फाइबर की संख्या थ्रोम्बिन इलाज से पहले और बाद में व्यक्ति की कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, प्रयोगात्मक समूहों के बीच चयन पूर्वाग्रह को नष्ट करने.
इस प्रोटोकॉल के साथ हम सेल बढ़त और actin तनाव फाइबर की गतिशील गति का मूल्यांकन. Photobleaching के बाद endothelial कोशिकाओं, प्रतिदीप्ति वसूली जैसे और अधिक उन्नत तकनीकों में actin monomer गतिशीलता (FRAP) समझने या प्रतिदीप्ति माइक्रो धब्बा15 प्रतिलिपि (FSM) लागू किया जा सकता है, 16 . इसके अलावा, क्योंकि microvascular endothelial कोशिकाओं microvascular बाधा समारोह का एक बेहतर मॉडल, अभिकर्मक प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए प्रभावी ढंग से microvascular endothelial कोशिकाओं में GFP-actin व्यक्त एक तार्किक भविष्य की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
सारांश में, GFP-actin व्यक्त रहते endothelial कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए निर्धारित कैसे endothelial सेल actin cytoskeleton उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकार का जवाब एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. कसकर सहधारा endothelial monolayers का उपयोग अध्ययन actin अमीर lamellipodia और endothelial बाधा समारोह में अनुप्रस्थ चाप तनाव फाइबर के रूप में गतिशील संरचनाओं की भूमिका का निर्धारण में मदद मिलेगी. इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं व्यक्त GFP-actin या अन्य संलयन प्रोटीन है कि अन्य subcellular संरचनाओं के दृश्य की अनुमति का जीना सेल इमेजिंग विस्तृत spatiotemporal आवश्यक जानकारी प्रदान करने के लिए संकेतन और संरचनात्मक तंत्र समझ जाएगा कि घetermine बाधा अखंडता.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GFP-β-actin प्लाज्मिड उदारता डा. Wayne Orr, LSUHSC-एस पैथोलॉजी विभाग द्वारा प्रदान की गई थी, और डॉ. बेकी Worthylake, LSUHSC – सं भेषजगुण विभाग की प्रयोगशाला में परिलक्षित किया गया था. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (आरआर-018,766 P20) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (05835386N) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 1. Ringer 5x Stock | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Sodium Chloride | EMD | SX0420-3 | 35 g |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040 | 1.75 g |
| Calcium Chloride | Sigma | C-3881 | 1.47 g |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M-9397 | 1.44 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 2. MOPS buffer | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| MOPS | Sigma | M3183 | 125.6 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS) | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Ringer stock (5x) | N/A | N/A | 200 mL |
| Mops Buffer | N/A | N/A | 5 mL |
| Sodium Phosphate | Sigma | S-9638 | 0.168 g |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | 0.22 g |
| EDTA sodium salt | Sigma | ED2SS | 0.0074 g |
| Glucose | Sigma | G7528 | 0.901 g |
| Albumin, Bovine | USB | 10856 | 10 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Adjust pH to 7.4 at 37°C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C. | |||
| 4. 0.9% Saline | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Sodium Chloride | EMD | SX0420-3 | 9 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 5. 1.5 % Gelatin Solution | |||
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500 | 15 g |
| 0.9% Saline | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Warm the solution to 37°C to dissolve gelatin sufficiently. While still warm, sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C | |||
Referenzen
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Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin. J. Vis. Exp. (57), e3187, doi:10.3791/3187 (2011).