डीएनए मेथिलिकरण: Bisulphite संशोधन और विश्लेषण
Summary
डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए सोने के मानक bisulphite परिवर्तित डीएनए के जीनोमिक अनुक्रमण है. इस विधि के साथ तुलना (5 MEC) 5 – मिथाइलसिटोसाइन अम्लीय शर्तों के तहत deamination bisulphite साइटोसिन की वृद्धि की संवेदनशीलता का लाभ लेता है. Unmethylated cytosines लक्ष्य जीनोमिक डीएनए पीसीआर प्रवर्धन के बाद methylated cytosines से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
Abstract
Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5′-CpG-3′ dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG “islands” commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the “gold standard” for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine “C” versus thymine “T” residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.
Protocol
Discussion
डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण bisulphite परिवर्तित डीएनए के जीनोमिक अनुक्रमण द्वारा एक अच्छी तरह से स्थापित है और बहुमुखी तरीका है कि पहचान और एकल nucleotide संकल्प पर डीएनए मेथिलिकरण की मात्रा का ठहराव की सुविधा है. हालांकि, bisulphite रूपांतरण और बाद में विश्लेषण के आधार पर निर्भर करता है कि डीएनए पूरी तरह से हर unmethylated साइटोसिन uracil deaminated जा रहा है और केवल methylated cytosines संयुक्त राष्ट्र के प्रतिक्रियाशील शेष के साथ परिवर्तित किया गया है. यदि रूपांतरण अपूर्ण है, समस्याओं के विश्लेषण के साथ पैदा बाद से बेबदल unmethylated cytosines गलत methylated cytosines के रूप में व्याख्या की जा सकता है. Bisulphite रूपांतरण विभिन्न स्तरों पर अनुकूलित किया जा सकता है के लिए रूपांतरण के प्रतिशत को अधिकतम. के लिए डीएनए पूरी तरह से परिवर्तित किया जा यह पहली एकल इतना है कि साइटोसिन अवशेषों bisulphite आयनों को उजागर कर रहे हैं चाहिए फंसे. पहला कदम, डीएनए विकृतीकरण, महत्वपूर्ण है और अधूरा रूपांतरण के स्रोत हो सकता है अगर डीएनए पूरी तरह से विकृत नहीं है सकते हैं. सुनिश्चित करने के लिएकि डीएनए पूरी तरह से विकृत है यह महत्वपूर्ण है कि हटाने, सभी जुड़े प्रोटीन की उचित नमक एकाग्रता, ऊष्मायन तापमान और समय सहित प्रतिक्रिया मापदंडों एकल असहाय रचना में डीएनए को बनाए रखने के लिए उपयुक्त हैं. यह महत्वपूर्ण है के लिए ताजा 3M NaOH का उपयोग और पर्याप्त ऊष्मायन समय की अनुमति है. यदि डीएनए विकृतीकरण विरोध है, 30 मिनट के लिए ऊष्मायन समय विस्तार या डीएनए fragmenting विकृतीकरण के लिए पहले सहित प्रोटोकॉल के लिए कुछ संशोधनों डीएनए विकृतीकरण सुविधा हो सकती है. इसके अलावा, एकल असहाय डीएनए (ssDNA) bisulphite रूपांतरण प्रतिक्रिया के दौरान असहाय डीएनए (dsDNA) डबल फिर से पानी रखना हो सकता है. या तो समय समय पर, या bisulphite प्रतिक्रिया के दौरान लगातार एक उच्च तापमान (90-95 डिग्री सेल्सियस) पर प्रतिक्रिया का भार उठाते ssDNA के रखरखाव में सहायता कर सकते हैं. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है पता है कि डीएनए गिरावट बहुत इन उच्च तापमान पर त्वरित हो. विभिन्न अभिकर्मकों भी वीं के फिर annealing को बाधित करने के लिए जोड़ा जा सकता हैई यूरिया के रूप में डीएनए strands.
डीएनए और इसकी गुणवत्ता की एकाग्रता भी bisulphite प्रतिक्रिया और अंतिम पीसीआर उपज की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. डीएनए गिरावट bisulphite रूपांतरण प्रोटोकॉल की एक सीमा है. डीएनए के रासायनिक उपचार ssDNA में विभिन्न भूग्रस्त टूटता है और कठोर उच्च bisulphite एकाग्रता, लंबी ऊष्मायन बार डीएनए गिरावट तेज कर सकते हैं सहित पूरा bisulphite रूपांतरण के लिए आवश्यक शर्तों के कुछ परिचय. मानक प्रतिक्रिया वर्णित शर्तों के तहत, डीएनए क्षरण एक आम समस्या है लेकिन नहीं है, यदि प्रोटोकॉल संशोधनों पेश कर रहे हैं, जैसे दृश्यों कि रूपांतरण के लिए आग रोक कर रहे हैं के लिए, टेम्पलेट्स है कि अपमानित या FFPE नमूने के रूप में ऐसे गरीब गुणवत्ता के हैं डीएनए के लिए, तब डीएनए गिरावट एक महत्वपूर्ण सीमा बन सकता है.
Formalin तय आयल, (FFPE) एम्बेडेड और अपमानित डीएनए नमूने प्रभावी ढंग से और परिवर्तित bisulphite प्रवर्धित इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन संशोधनों करने के लिए सुनिश्चित करें कि डीएनए आगे अपमानित नहीं है की सलाह दी जाती है. t शाही सेना के रूप में एक कैरियर के शाही सेना के इस्तेमाल की सिफारिश की है . इसके अलावा ग्लाइकोजन एक वाहक के रूप में जोड़ा जा सकता है जब डीएनए एकाग्रता कम (<200 एनजी). क्योंकि FFPE ऊतकों से अलग डीएनए पहले ही खंडित है और आगे विखंडन deamination के दौरान जगह लेता है, देखभाल आगे गिरावट को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. टुकड़ा डीएनए विकृतीकरण से पहले किसी भी आगे मत करो और 4 घंटे के लिए bisulphite प्रतिक्रिया के लिए ऊष्मायन समय सीमा. डिजाइन और नहीं खंडित डीएनए के लिए 300 कारण बीपी से बड़ा amplicons.
एक और पहलू है कि पीसीआर प्रवर्धन को प्रभावित है कि unmethylated cytosines की bisulphite रूपांतरण डीएनए टेम्पलेट की जटिलता को कम कर सकते हैं. निम्नलिखित प्राइमर डिजाइन प्रोटोकॉल खंड 4.1, वृद्धि हुई प्राइमर लंबाई और नेस्टेड पीसीआर में उल्लिखित सभी को विशिष्टता और पीसीआर उपज बढ़ाने में मदद कर सकते हैं.
अंत में, डीएनए टेम्पलेट के बाद bisulph के दौरान बदल दिया हैite रूपांतरण, प्रवर्धन पूर्वाग्रह एक चिंता का विषय होना कर सकते हैं. सुनिश्चित करें कि methylated और unmethylated टेम्पलेट्स के आनुपातिक पीसीआर प्रवर्धन नियंत्रण 50/50 / एम यू डीएनए मिश्रण के साथ की जाँच की है, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लिखित, चित्रा 3 देखें. इसके अलावा कि केवल परिवर्तित टेम्पलेट्स के प्रवर्धन सुनिश्चित HpaIII प्रतिबंध एंजाइम और जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए उत्पन्न हो रही है. पीसीआर स्थितियों के लिए अलग तापमान और / या मैग्नीशियम एकाग्रता या विस्तार के समय लंबी द्वारा अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है. कुछ टेम्पलेट्स के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो दिखाई देते हैं और प्राइमर की स्थिति को समायोजित करने की जरूरत है या प्राइमरों पतित हो सकता है की जरूरत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तकनीक को तेजी से करने के लिए एक समान संकल्प प्राप्त करने के लिए जीनोमिक अनुक्रमण bisulphite विकसित हो रहे हैं, और तीसरी पीढ़ी के एकल अणु अनुक्रमण bisulphite अनुक्रमण के लिए आवश्यकता के बिना दोनों को प्राथमिक और डीएनए मेथिलिकरण के विश्लेषण के लिए अनुमति की क्षमता है. हालांकि, व्यापक उपलब्धता और कल्पनाइन तकनीकों का ificity कुछ समय दूर रहते हैं. Bisulphite जीनोमिक अनुक्रमण मेथिलिकरण विश्लेषण में सोने के मानक है और एक मजबूत प्रोटोकॉल है. विधि बिंदु जहां आम समस्याओं और सीमाओं को हल कर दिया गया है करने के लिए प्रगति की है और अनुप्रयोगों के व्यक्ति के जीन के विश्लेषण से उच्च throughput और पूरे जीनोम विश्लेषण क्लार्क एट अल द्वारा वर्णित करने के लिए विस्तारित किया है +२००६ 4.. समस्या निवारण दिशानिर्देशों और अतिरिक्त सिफारिशों तालिका 1 में उल्लिखित हैं. यह सुझाव दिया है कि इष्टतम दृष्टिकोण के शुरू में मानक प्रोटोकॉल का पालन करें और केवल अगर संशोधन और जब कोई समस्या पैदा होती परिचय है.
1 टेबल समस्या निवारण दिशानिर्देश.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
- Sodium Metabisulphite (Ajax Finechem)
- Hydroquinone (Merck)
- Wizard DNA-clean-up system (Promega)
Referenzen
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).
- Clark, S. J. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).
