الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.
يمكن للأحداث في وقت مبكر من التفاعل بين الفيروس والخلية لها تأثير عميق على نتيجة العدوى. ويمكن تحديد العوامل التي تؤثر على هذا التفاعل يؤدي إلى تحسين فهم المرض والتسبب بالتالي التأثير على تصميم أو لقاح علاجي. وبالتالي ، فإن تطوير وسائل لتحقيق هذا التفاعل مفيدا. ويمكن استغلال التطورات الأخيرة في التنمية fluorophores 1-3 و تكنولوجيا التصوير 4 إلى تحسين معرفتنا الحالية على المرضية بحمى الضنك ، وبالتالي تمهيد الطريق للحد من الملايين من الإصابات بحمى الضنك التي تحدث سنويا.
فيروس حمى الضنك يلفها له سقالة الخارجية التي تتكون من dimers المغلف 90 (E) بروتين سكري حماية قذيفة nucleocapsid ، الذي يحتوي على حبلا واحدة إيجابية رنا الجينوم 5. وبالتالي يمكن أن مفارز متطابقة البروتين على سطح الفيروس يكون المسمى مع صبغة an رد الفعل من خلال تصور وأمين المجهري مناعي. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لوضع العلامات لفيروس حمى الضنك مع اليكسا فلور succinimidyl استر الصبغة الذائبة مباشرة في بيكربونات الصوديوم العازلة التي أسفرت عن الفيروس مجدية للغاية بعد وضع العلامات. لا توجد إجراءات موحدة لوضع العلامات على فيروسات حية والبروتوكول الصانع القائمة لوضع العلامات البروتين وعادة ما يتطلب إعادة تشكيل الصبغة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل. وجود ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، حتى بكميات صغيرة ، يمكن منع العدوى من فيروس الإنتاجية وتحفز أيضا السمسة 6 خلايا. استبعاد استخدام سلفوكسيد ثنائي ميثيل في هذا البروتوكول وبالتالي تقليل هذا الاحتمال. الكسا الأصباغ فلور وصمود للضوء متفوقة ودرجة الحموضة أقل حساسة من الأصباغ المشتركة ، مثل فلوريسئين ورودامين 2 ، مما يجعلها مثالية لإجراء دراسات عن امتصاص الخلوية والنقل endosomal الفيروس. لم اقتران اليكسا فلور صبغة لا يؤثر على الاعتراف الفيروس المسمى بفيروس حمى الضنك ، ومستقبلات محددة الأضداد المفترضة لها في الخلايا المضيفة 7. هذا الأسلوب يمكن أن تكون لها تطبيقات مفيدة في الدراسات الفيروسية.
على الرغم من أن استخدام صبغة AF594 في هذا التقرير ، مجموعة واسعة من fluorophores في سلسلة فلور اليكسا استرات succinimidyl يتوفر مع العلامات الكيمياء مماثلة. ويمكن توسيع نطاق تطبيق هذا الوسم خارج التصوير. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي كبديل للمبائر المجهري لتقدير درجة لوسم fluorophores ال…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، وسنغافورة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
M-199 | Invitrogen | 11150 | |
FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
4-well plate | Nunc | 176740 | |
Coverslips | Einst | 0111520 | |
Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.