Isolatie & Karakterisering van Hoechst ^Lage CD45 ^Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

1. Lung Isolatie Offer volwassen muizen (8-10 weken in leeftijd, 18 tot 20 g; C57Bl6J) muizen met een overdosis van isofluraan, gevolgd door verbloeding met steriele techniek. Profielen enigszins verschillen tussen stammen. Chirurgisch te verwijderen het middenrif, open de borstholte door het snijden van de borstkas zijdelings aan beide zijden van de muis. Spoel het bloed uit de longen door perfuseren de rechter hartkamer zachtjes met 3-5mls van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Ontleden van de longkwabben het verwijderen van de luchtpijp en de grote bronchi en doe dit in een petrischaal gevuld met Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS). Na de verzameling van alle longkwabben tang wordt gebruikt om weefsel plaatsen op het deksel van de schotel. Weefsel wordt vervolgens gehakt in kleine stukjes met behulp van disposable scalpels met voldoende vloeistof om ze vochtig, maar niet zo veel dat ze zweven en bewegen. Ontleden een achterbeen van een van de muizen en isoleren het beenmerg te gebruiken als een kleuring controle om de flo te stellenw cytometrie poorten. Stain het beenmerg (BM) zoals eerder beschreven 1. 2. De voorbereiding van een enkele celsuspensie van longweefsel Elke long wordt verteerd door middel van een geoptimaliseerde tissue gewicht tot volume-verhouding van 0,2 g: 5mls van voorverwarmde 0,2% Worthington type 2 collagenase (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; cat # LS004202) opgelost in een steriele HBSS. Het mengsel wordt ondergedompeld in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten 2,3. Goed Vermaal monster tot longweefsel verteren stroomt gemakkelijk door een 10 ml pipet (ongeveer 10 herhalingen). Incubeer nog eens 15 min bij 37 ° C in te vullen het weefsel verteert en zorgt voor een meer uniforme enkele celsuspensie. Verdun de long celsuspensie met HBSS en vermaal met een 5 ml pipet om de resterende weefsel fragmenten uiteen te drijven. Filter de suspensie op met een 70μM cel zeef om onverteerd weefsel fragmenten te verwijderen. Monster kan worden verdeeld in multiple conische buizen op dit punt te voorkomen overbelasting van een cel filter en vermindert de tijd. Pellet de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 1500 rpm en decanteer het supernatant. Resuspendeer celpellet zachtjes met kamertemperatuur RBC lysis buffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) en incubeer bij RT gedurende 5 minuten. Voeg een gelijk volume van HBSS naar de lysis buffer inactiveren en de celsuspensie met behulp van een 40μM cel zeef om vuil en cel aggregaten te verwijderen filter. Pipetteer 10μl van elk monster te worden gemerkt en tellen celaantallen voor zowel de long-en BM monsters met behulp van een hemocytometer. Let op: neem het totale volume van de cellen. Pellet de enkele celsuspensie van longcellen door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 10 minuten. Resuspendeer zowel long-en BM cellen op 1×10 6 cellen / ml in voorverwarmde (37 ° C) DMEM + (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, hoog glucose (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) met 2% foetaal bovine serum (FBS) en 10mm HEPES. Bereid een 1mg/ml voorraad oplossing van Hoechst 33342 kleurstof (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) in water en filter steriliseren 1,4. De Hoechst kleurstof kan worden opgeslagen als aliquots bij -80 ° C. Voeg Hoescht 33342 kleurstof tot een uiteindelijke concentratie van 5μg/ml (een 200x verdunning van een 1mg/ml voorraad) om de enkele celsuspensie. Meng de cellen door zachtjes inversie en incubeer bij 37 ° C waterbad gedurende precies 90 minuten. 3. Kleuring en Voorbereiding van de Lung celsuspensie voor flowcytometrie-analyse Na 90 minuten alles in het werk met Hoechst gekleurde long-cellen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C of op ijs te verven efflux te voorkomen. Pellet de cellen door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer de cellen in ijskoude vlekken buffer (PBS +2% FBS). Resuspendeer cellen bij een concentratie van niet meer dan 1×10 7 cellen / tube met behulp van 300-600μl van PBS met 2S en 10 mM HEPES. Voeg adequaat giechelde CD45 antilichaam (meestal 1:200 verdunning van CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864) om de longen en BM samples Incubeer op ijs gedurende 10-15 minuten Inclusief een onbesmet controle tijdens de.. experimentele procedure is nuttig om de analyse poorten in te stellen. Pellet-cellen bij 4 ° C gedurende 5 min bij 1500 rpm. Giet het supernatant en resuspendeer cellen in 500 pi van gekoelde vlekken buffer (PBS +2% FBS). Transfer naar prechilled snap cap polypropyleen buizen (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). Voeg propidiumjodide (PI, 200μg/ml voorraad in PBS) om de monsters voor een uiteindelijke concentratie van 2μg/ml om dode cellen te sluiten. PI moet worden gebruikt in combinatie met de Hoechst 33342 kleurstof op het juiste fluorescentie profiel op flowcytometrische analyse te bereiken. Store buizen op ijs, beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse. 4. Flowcytometrie-analyse te definiëren en te isolereneen Lung mesenchymale stamcellen (MSC long) Bevolking met behulp van Hoechst kleurstof Uitlooptijd om een ​​side population (SP) op te sporen Deze test heeft de volgende instrument eisen: 488 nm en UV (350-355 nm) lasers 2 detectoren op de UV-laser pad met blauw (450/65) en rood (675/50) filters. De UV-rode detector moet een hoge gevoeligheid voor het rode signaal. Dit kan een probleem met oudere cel sorteerders worden. Koelmachine op het monster te handhaven op 5-10 ° C. Lijn lasers en opgezet voor celsortering volgende protocol van de fabrikant. Verzamel de rode (x-as) en blauw (y-as) Hoechst signalen met behulp van een lineaire schaal. Stel de fotomultiplicatorbuis spanningen aan de G0/G1 hoogtepunt plaats in de rechterbovenhoek van het midden op het perceel toe te staan ​​voor een adequate weergave van de trailing side population. Een deel van de S-fase en de gehele G2 van de celcyclus kan off-schaal in de rechterbovenhoek van het perceel. De blauwe siginterne is relatief helder, terwijl het rode signaal is afm. Typische MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) spanningen 425 voor de blauwe en 650 voor de rode. Dode cellen worden gated met behulp van PI. De standaard PI pad (excitatie 488nm, 630nm emissie) kunnen worden gebruikt. Als alternatief is PI ook enthousiast over de UV-laser en de dode cellen bevolking ligt buiten de schaal aan de rechterkant van de side population (SP) plot. Dit vermindert de noodzaak om de PI-signaal van andere fluorochromen zoals FITC en PE te compenseren. De oorspronkelijke Goodell gevolgde methode voor laatstgenoemde procedures 5-7. Onderhouden van een relatief lage drukverschil tijdens de analyse en sorteren strakke resolutie van de kant bevolking te waarborgen. De SP ziet eruit als een zijarm los van de belangrijkste populatie van longcellen. Deze populatie is genoemd Hoechst laag. De lage Hoechst / SP is geanalyseerd om de CD45 positieve en negatieve populaties met behulp van een histogram 2,3 (F apartigure 1). Na de selectie en gating van de Hoechst lage CD45 neg long MSC de bevolking van de cellen kunnen worden verzameld door het sorteren als ofwel een gemengde bevolking in een buis of enkele cellen te klonen te isoleren in een 96-wells plaat 3. Voor het sorteren van de plaat soort stroom afbuiging is ingesteld op 25% tot een meer verticale soort stroom dan meestal gebruikt voor het sorteren buis te creëren. Doel van het soort stroom door het sturen van een test stroom puls op de bovenste links en dan de rechter ook van een 96-wells plaat. Stel de sorter software plaat kaart om het gewenste aantal cellen storten elk putje. Te isoleren enkele cel klonen een enkele long MSC wordt gesorteerd in de put van een 96-wells plaat in 150μl van cultuur media (α-MEM aangevuld met 20% FBS). Naar aanleiding van de soort een extra 100μl van medium wordt toegevoegd. 5. Isolatie, Cultuur en karakterisatie van long MSC en Clones Culture en uitbreiding van de gemengde long MSC populatie en single cell klonen na het sorteren is identiek met behulp van standaard kweekomstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 en> 95% luchtvochtigheid). Cellen mogen volgende isolatie houden gedurende 16 uur. Media is vervangen om de 48 uur (α-MEM aangevuld met 20% FBS). Wanneer de cellen beginnen te sneller prolifereren en te bereiken tussen de 75-80% confluentie ze zijn gepasseerd (figuur 2). Cellen worden gespoeld met voorverwarmde HBSS en geïncubeerd met 0,5% trypsine / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) bij 37 ° C voor minder dan 2 minuten. Cellen worden gecontroleerd met behulp van een omgekeerde mogelijkheden om het uiterlijk van een celsuspensie te bevestigen. Lung MSC worden dan verdeeld in verhouding van 1:2 of 1:3, afhankelijk van de huidige wildgroei koers van de cultuur. Het vermogen van de longen MSC om te differentiëren in de traditionele mesenchymale lineages van osteoblast, adipocyten en chondrocyten en hun cel-oppervlakte-expressie van de geaccepteerde mesenchymale markers is geëvalueerd voor elke cel voorbereiding. Cytogenetische banding analyse wordt ook uitgevoerd om de afwezigheid van de bruto-chromosomale afwijkingen 2,3,8-11 te bevestigen. 6. Opsomming van long MSC met behulp van een kolonievormende assay (CFU-F) Verdunnen cellen in Complete MesenCult medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) tot een uiteindelijke concentratie van 1×10 6 cellen / ml. Seriële verdunningen uit te voeren tot de uiteindelijke concentraties te bereiken in een 100mm schaal van 6×10 4 cellen, 3×10 4 cellen, 1,5 x10 4 cellen en 0,75 x10 4 cellen in 10 ml van de media. Analyses worden uitgevoerd in twee-of drievoud voor elke cel de concentratie en kan worden geschaald voor kleinere oppervlakten. Cultuur cellen gedurende 10 dagen onder standaard omstandigheden. Op dag 10 cellen worden gespoeld met PBS en gefixeerd met behulp van 100% methanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Detecteren de CFU-F kolonies door kleuring met 0,4% w / v Giemsa kleuroplossing(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) verdund 1:20 met gedemineraliseerd water. Laat monsters aan de lucht drogen en te kwantificeren van het aantal kolonies die meer dan 25 cellen per kolonie (figuur 3). 7. Analyse van de immuunmodulerende eigenschappen van de long MSC op T-cel proliferatie en apoptose 6.25×10 4 long MSC-cellen per well worden uitgeplaat in 96-well platen en toegestaan ​​om 's nachts 2 staan. CD4 + cellen van de milt van T-cel receptor (TCR) transgene muizen, OT-II met T-cellen die de ovalbumine 323-339 peptide herkennen, worden gezuiverd door middel van putten CD8 +, CD19 +, MHC-II + en CD25 + cellen met een Miltenyi AutoMACS cell sorter (Miltenyi, Auburn, CA). Antigeen presenterende cellen (APC) worden geïsoleerd door positief te sorteren MHC-II + cellen 12. APC worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, drie keer gewassen in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, en geladen met 0.5μg/ml of 5μg / ml OVA323 peptide. Gesimuleerd, de groei gearresteerd APC worden toegevoegd aan de longen MSC in 96-well platen. Meer dan 95% zuiver CD4 + 1×10 5 cellen zijn voorzien van 5 urn carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE, Sigma, St. Louis MO) in PBS en geïncubeerd gedurende 5 minuten in het donker, gewassen met PBS-5% BSA, en vervolgens toegevoegd aan de APC en de longen MSC-cellen in DMEM 5% FBS media. Cellen worden vervolgens geïncubeerd gedurende 96 uur. T-cellen worden dan gekleurd met anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); vbeta 5 (PE) en geanalyseerd met behulp van een Miltenyi MacsQuant 7 kanaals flowcytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) en de Flojo analyse software (Treestar, Ashland, OR). Proliferatie wordt gemeten als de daling van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de CFSE ten opzichte van de achtergrond, T-cellen gelabeld met CFSE en niet blootgesteld aan APC (figuur 4). T-cellen worden geteld op dit moment en de levensvatbaarheid beoordeeld met trypan blauw uitsluiting. 8. Representatieve resultaten: <p class="Jove_content"> Figuur 1. Flowcytometrische analyse en definitie van Lung MSC. Enkele cel suspensies van longweefsel verteren zijn gekleurd met Hoechst 33342 en geanalyseerd door flowcytometrie om verschillen in A te detecteren. forward scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) en B. Hoechst blauwe en rode fluorescentie. De aanwezigheid van een side population (SP) is zichtbaar in de poort. De Hoechst lage SP is vervolgens geanalyseerd om de C te scheiden. CD45 negatieve bevolking van long MSC. De CD45 positief naar negatief verhouding van long SP zijn typisch 70:30 / 60:40. Figuur 2. Isolatie en Cultuur van Lung MSC. Na de winning van de long door MSC celsortering, zijn de cellen uitgeplaat in 30mm gerechten met α-MEM supplemteerde met 20% FBS. A. Vers gesorteerde cellen lijken klein, rond en helder. B. Na ongeveer 2-3 weken kolonies met een mesenchymale fenotype duidelijk geworden en de proliferatie is meer voor de hand. Figuur 3. Telling van MSC door kolonievormende-Fibroblast Assay. Expanded longen MSC zijn vergulde per de beschreven protocol voor de CFU-F-test. A. Na 10 dagen en Giemsa vlek kolonies zijn duidelijk. B. Kolonies zijn groot en bestaan ​​uit een paar honderd cellen. C. De cellen vertonen een mesenchymale fenotype. A & B, Schaal bar = 0,5 cm; C Schaal bar = 0,14 cm. Figuur 4. CFSE basis van T-cel proliferatie Assay. Bij afwezigheid van longen MSC en de aanwezigheid van antigen presenterende cellen (APC) + / – ovalbumine (OVA), CD40-positieve effector T-cellen aan te tonen een afname van de intensiteit die CFSE proliferatie aangeeft (rode cirkel). CFSE fluorescentie-intensiteit van de T-cel membraan daalt stoichiometrisch met elke celdeling dwz. bij elke divisie. In aanwezigheid van long MSC, APC + / – OVA, CD40 positieve effector T-cellen aan te tonen geen significante verandering in CFSE intensiteit die een gebrek aan proliferatie geeft aan (rode cirkel).