Hoechst의 분리 및 특성 ^낮은 CD45 ^부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

1. 폐 격리 멸균 기술을 사용 과다 다음 isoflurane의 과다와 생쥐 성인 쥐 (C57Bl6J,, 18-20그램 시대에 80~10주) 희생. 프로필 변종 사이에 약간 달라집니다. 수술, 횡경막을 제거하려면 마우스의 양쪽 옆으로 ribcage를 절단하여 흉강을 엽니다. 인산의 3 5mls를 사용하여 부드럽게 오른쪽 심장 심실을 perfusing하여 폐에서 혈액을 플러쉬 식염수 (PBS)는 버퍼. (HBSS) 염분 버퍼 행크스 가득 배양 접시에있는 기관 및 대형 기관지과 장소를 제거하는 폐 엽 (叶)을 해부하다. 모든 폐 엽 (叶)의 집게의 다음 컬렉션은 접시의 뚜껑에 조직을 배치하는 데 사용됩니다. 조직은 다음 그들은 부유하고 이동 있도록 많은 그들 촉촉한 아니지만 유지하는 충분한 액체와 일회용 scalpels를 사용하여 작은 조각으로 다진 있습니다. 쥐를 중 하나 hindlimb을 해부하다와 플로 설정 얼룩 컨트롤로 사용할 수있는 골수를 분리w cytometry 게이츠. 골수 (BM)로 이전 한 설명을 얼룩. 2. 폐 조직에서 단일 세포 현탁액의 준비 , 무균 HBSS에 녹아있는 미리 예열 0.2 % 워딩턴 2 형 collagenase (CAT # LS004202 워싱턴의 Biochemicals, 레이크 우드, 뉴저지)의 5mls 각 폐는 0.2g의 부피 비율에 최적화된 조직 무게를 사용하여 소화됩니다. 혼합물은 30 분 2,3에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 포장되어 있습니다. 폐 조직 소화가 10ml 피펫 (약 10 반복)를 통해 쉽게 흐르는 때까지 샘플을 씹다. 37 추가 15 분 품어 ° C는 조직이보다 균일한 단일 세포 현탁액을 소화하고 보장 완료. HBSS와 폐암 세포 현탁액을 희석하고 잔여 조직 조각을 해산하기 위해 5ml 피펫과 씹다. 소화되지 않은 조직 파편을 제거하는 70μM 셀 스트레이너를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 샘플 multipl로 나눌 수 있습니다이 시점에서 전자 원뿔 튜브 하나의 셀 스트레이너를 오버로드 방지하고 시간을 감소합니다. 펠렛 1,500 RPM과 가만히 따르다 뜨는 10 분 세포 현탁액. 5 분 RT에서, 부화, Resuspend 세포 펠렛 부드럽게 방 온도 RBC 용해 버퍼를 (CAT # 00-4333-57 eBiosciences, 샌디에고, CA)를 사용하여. 용해 버퍼를 inactivate과 파편과 세포 집계를 제거하는 40μM 셀 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 필터링하는 HBSS의 동일한 볼륨을 추가합니다. 각 샘플의 피펫 10μl는 스테인드하고 폐 및 hemocytometer를 사용하여 BM 샘플 모두에 대한 셀 번호를 계산합니다. 참고 : 세포의 전체 볼륨을 기록합니다. 펠렛 10 분 1,500 rpm으로 원심 분리하여 폐 세포의 단일 세포 현탁액. 포함하는 고양이 # 11965-092) 2퍼센트 태아 bovi, prewarmed에 1×10 6 셀 / ML (37 ° C) DMEM + (Dulbecco의 수정 이글 배지, 높은 혈당 (Gibco, Carlsbad, CA에서 폐 및 BM 세포 모두 ResuspendNE 혈청 (FBS)와 10mM HEPES. Hoechst 33342 염색 (시그마 화학 회사, 세인트 루이스, MO, 고양이 # B2261)의 1mg/ml 재고 솔루션을 준비 물과 1,4을 소독 필터링합니다. Hoechst의 염료는 -80 ° C.에 aliquots으로 저장될 수 있습니다 단일 세포 현탁액에 5μg/ml의 최종 농도 (1mg/ml 주식의 200x 희석)에 Hoescht 33,342 염료를 추가합니다. 37 정확히 90 분 ° C의 물을 욕조에 부드럽게 역전과 부화하여 세포를 섞는다. 3. 얼룩 및 유동세포계측법 분석을위한 폐 세포 현탁액의 준비 90 분 후 Hoechst 스테인드 폐 세포의 모든 단계 ° C 또는 염료 유출을 방지하기 위해 얼음에 4 실행해야합니다. 4 10 분 1,500 rpm으로 원심 분리하여 펠렛은 세포 ° C와 얼음처럼 차가운 얼룩 버퍼 (PBS 2퍼센트 FBS)에 세포를 resuspend. PBS 2 %를 포함하는 300 – 600μl를 사용하여 더 이상 7 1×10 이상의 세포 / 튜브의 농도에서 세포 ResuspendFBS 및 10mM HEPES를. 폐 및 BM 샘플에 고양이 # 559864) 10-15 분 얼음 품어 동안 흠없는 컨트롤 포함,.. 적절하게 CD45 항체를 (일반적으로 CD45 – APC의 1:200 희석 (BD Pharmingen, 샌디에고, CA tittered 추가 실험 절차는 분석 성문을 설정하는 데 유용합니다. 4 펠렛 세포 ° C 1500 rpm으로 5 분. 냉장 얼룩 버퍼 (PBS 2퍼센트 FBS) 500 μl에 뜨는 및 resuspend 세포를 가만히 따르다. (; 고양이 # 14-956 – 1D Fisherbrand, Schaumburg, IL) prechilled 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 전송. 죽은 세포를 제외 2μg/ml의 최종 농도에 대한 샘플에 (PI, PBS에 200μg/ml 주식) propidium 요오드화물의를 추가합니다. PI는 흐름 cytometric 분석시 올바른 형광 프로필을 달성하기 위해 Hoechst 33342 염색와 함께 사용해야합니다. 얼음에 저장 튜브는 유동세포계측법 분석까지 빛으로부터 보호. 4. 유동세포계측법 분석 정의 및 분리하는사이드 인구 (SP)를 감지하는 Hoechst 염료 유출을 사용하여 폐 Mesenchymal의 줄기 세포 (MSC 폐) 인구 이 분석은 다음과 악기 요구 사항이 있습니다 : 488 NM 및 UV (350-355 nm의) 레이저 파란 (65분의 450)과 빨간색 (50분의 675) 필터와 UV 레이저 경로 2 경보기. UV 붉은 감지기가 빨간 신호에 대한 높은 감도를 가지고 있어야합니다. 이것은 오래된 세포 sorters 문제있을 수 있습니다. 50-10에서 샘플을 유지하기 위해 냉각기 장치 ° C. 레이저를 정렬하고 제조 업체의 프로토콜 다음과 같은 세포 분류에 설정합니다. 빨간색 (X 축)과 파란색 (Y 축) 선형 스케일을 사용하여 Hoechst 신호를 수집합니다. 후행 측면 인구의 적절한 표시할 수 있도록 줄거리 중심의 오른쪽 상단의 G0/G1 피크를 배치하는 photomultiplier 튜브 전압을 조정합니다. 세포주기의 S – 위상 및 전체 G2의 부분은 줄거리의 오른쪽 상단에있는 오프 스케일 수 있습니다. 파란색 시그마붉은 신호가 희미 동안 nal은 비교적 밝은 있습니다. 일반 MoFlo XDP (베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, 마이애미, 플로리다) 전압은 파란색 425과 빨간색 6백50아르. 죽은 세포는 PI를 사용하여 밖으로 문이 있습니다. 표준 PI 경로 (여기 488nm, 방출 630nm)을 사용할 수 있습니다. 또한, PI는 또한 UV 레이저에 의해 흥분하고 죽은 세포 인구 측면 인구의 오른쪽 (SP) 줄거리에 대한 규모를 놓여있다. 이것은 FITC와 PE 등 다른 fluorochromes에서 PI 신호를 보상하기 위해 필요 완화. 원래 Goodell 방법는 5-7 후자 절차를 따랐다. 분석 기간 동안 상대적으로 낮은 압력 차등을 유지하고 측면 인구의 꽉 해상도를 보장하기 위해 정렬. SP 떨어져 폐 세포의 주요 인구의 측면 팔로 나타납니다. 이 인구는 Hoechst 낮은 칭했다입니다. Hoechst 낮은 / SP는 히스토그램 2,3 (F를 사용하여 CD45 긍정적이고 부정적인 인구를 분리하는 분석이다igure 1). Hoechst 낮은 CD45 neg 폐 MSC 인구의 선택과 게이팅 다음 전지는 96 – 웰 플레이트 3에 클론을 분리 튜브 또는 하나의 세포로하거나 혼합 인구로 분류하여 수집될 수 있습니다. 정렬 스트림 편향을 정렬 플레이트는 일반적으로 튜브 정렬에 사용되는보다 수직 정렬 스트림을 만드는 데 2​​5 % 조정에있다. 왼쪽 상단에 테스트 스트림 펄스를 전송하고 다음 96 – 웰 플레이트 잘 오른쪽 아래로 정렬 스트림을 목표로하고 있습니다. 각 우물에 세포의 원하는 번호를 입금 분류기 소프트웨어 플레이트지도를 설정합니다. 단세포 클론을 분리하려면 단일 폐 MSC는 문화 매체의 150μl (α – 가상 20% FBS와 보충)에 96 – 웰 플레이트에 잘으로 정렬됩니다. 정렬 다음 미디어의 추가 100μl이 추가됩니다. 5. 폐 MSC와 클론의 분리, 문화 및 특성 Cultur정렬 아래의 E와 혼합 폐 MSC 인구 및 단일 세포 클론의 확장 표준 문화 조건을 사용하여 동일 (37 ° C 5 % CO 2와> 95 % 습도). 세포는 16 시간 동안 다음과 같은 고립을 준수하기 위해 사용할 수 있습니다. 미디어는 (α – 가상 20% FBS와 보충) 매 48 시간 대체됩니다. 세포가 더 빨리 세포 분열 따위에 의해 번식하기 시작하고 그들이 passaged 아르 75-80%의 합류 (그림 2) 사이에 도달했을 때. 세포 prewarmed HBSS로 씻어서 0.5 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Cellgro, 매나 사스, VA, 고양이 # 25-053 – CL)과 incubated 아르 37 ° 2 분 미만에 대한 C. 세포는 세포 현탁액의 모양을 확인하는 거꾸로 범위를 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 폐 MSC는 다음 문화의 현재 확산 속도에 따라 1시 2분 또는 1시 3분의 비율로 나누어집니다. 전통적인 mesenchymal adipocyte와 chondrocyte osteoblast의 lineages 및 접수 mesenchymal 마커 그들의 세포 표면 표현으로 차별 폐 MSC의 기능 I의 각 세포 준비 평가. Cytogenetic banding 분석은 또한 총 염색체 이상 2,3,8-11의 부재를 확인하기 위해 수행됩니다. 6. 콜로니 형성 분석을 사용하여 폐 MSC의 열거 (CFU – F) 1×10 6 셀 / ML의 최종 농도를 완료 MesenCult 매체 (줄기 세포 기술, 밴쿠버, BC)에 세포를 희석. 6×10 4 셀, 3×10 4 셀, 미디어 10ml에 1.5 X10 4 셀 및 0.75 X10 4 셀 100mm 접시에 최종 농도를 달성하기위한 일련 dilutions를 수행합니다. 분석은 각 세포 농도에 대한 중복 또는 세중의에 수행하고 작은 표면 영역에 대한 크기를 조정있을 수 있습니다. 표준 조건 하에서 10 일간 문화 세포. 일 10 세포는 PBS로 씻어서 실온에서 5 분 100 % 메탄올을 사용하여 고정하고 있습니다. 0.4 % W / V Giemsa 염색법의 솔루션 얼룩하여 CFU – F의 식민지를 감지(시그마 화학 주식, 세인트 루이스, 미주리)은 탈이온수와 1시 20분을 희석. 공기 건조에 샘플을 허용하고 식민지 회 이상 25 세포 (그림 3)이있는 콜로니의 수를 계량. 7. T – 세포 증식 및 Apoptosis에 폐 MSC의 Immunomodulatory 속성 분석 물론 당 6.25×10 4 폐 MSC 세포는 96 – 웰 플레이트에 도금 및 야간 2 서 사용할 수 있습니다. CD4 + ovalbumin 323-339 펩타이드를 인식 T 세포와 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 변형 마우스, OT – II의 spleens의 세포는 +, CD19 +, MHC – II + 및 CD25 + 세포와 CD8을 파괴하여 정화 아르 Miltenyi AutoMACS 세포 분류기 (Miltenyi, 어번, CA). 항원 제시 세포 (APC)가 긍정적으로 MHC – II + 세포에게 12 정렬하여 절연하고 있습니다. APC는 4 % paraformaldehyde에 고정 PBS / 5% BSA/2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 번 씻어 및 0.5μg/ml 또는 5μg / M와 함께로드됩니다리터 OVA323의 펩타이드. APC를 체포 가상, 성장 96 – 웰 플레이트에있는 폐 MSC에 추가됩니다. 이상 순도 95 프로지 CD4 + 1×10 5 세포 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE, 시그마, 세인트 루이스, 미주리 주)로 표시 아르 PBS와 어둠 속에 5 분 incubated, PBS – 5 % BSA로 씻은 다음에 추가 DMEM 5% FBS 미디어에 APC와 폐 MSC 세포. 전지는 다음 96시간에 대한 incubated 수 있습니다. CD4 (APC – Cy7), CD8 (ViolBlue), T – 세포는 다음 안티 안티 CD40 (Cy5)에 묻은 게있다 Vbeta 5 (PE)와 Miltenyi MacsQuant 7 채널 흐름 cytometer (Miltenyi, Aurburn, CA)와를 사용하여 assayed FloJo 분석 소프트웨어 (Treestar, 애쉬 랜드, OR). 확산이 배경에 비해 CFSE의 의미 형광 강도의 감소로 측정, T 세포는 CFSE으로 표시하고 (그림 4) APC에 노출되지 않습니다. T – 세포는 trypan 파랑 제외로 평가된이 시간과 생존에 계산됩니다. 8. 대표 결과 : <p class="jove_content"> 그림 1. 흐름 cytometric 분석과 폐에 MSC의 정의. 폐 조직 다이제스트의 단세포 정지는 Hoechst 33342 물들일하고의 차이를 감지 유동세포계측법에 의해 분석됩니다. 앞으로 흩어 (FSC)와 측면 산란 (SSC)와 B. Hoechst 파란색과 빨간색 형광. 사이드 인구 (SP)의 존재는 게이트 볼 수 있습니다. Hoechst 낮은 SP는 다음 C를 분리하는 분석이다. 폐 MSC의 CD45 부정적인 인구. 폐 SP의 부정적인 비율로 CD45 양성은 일반적으로 70:30 / 60:40입니다. 그림 2. 폐에 MSC의 분리 및 문화. 셀 정렬하여 폐 MSC의 수집에 따라 세포는 α – 가상 supplem를 사용하여 30mm 요리를 도금 아르20% FBS와 ented.가. 갓 정렬 세포는 작은 원형 밝은 나타납니다. B는. mesenchymal 표현형로 ​​약 2-3 주 식민지가 분명지고 확산이 더 확실한되면. 그림 3. 콜로니 형성 – Fibroblast 분석하여 MSC의 열거. 확대 폐 MSC는 A. 10 일 후에. CFU – F 분석에 대해 설명한 절차에 따라 도금 및 Giemsa 얼룩 식민지가 분명 있습니다. B. 식민지가 큰 및 구성 몇백 세포. C. 세포가 mesenchymal 표현형를 표시합니다. A & B, 스케일 바 = 0.5 cm, C의 스케일 바 = 0.14 cm. 그림 4. CFSE 기반의 T 세포 증식 분석. 폐암의 MSC와 antige의 존재의 부재에N 발표 세포 (APC)는 + / – ovalbumin (OVA) CD40 양성 이펙터 T 세포는 (붉은 동그라미) 확산을 나타냅니다 CFSE 강도의 감소를 보여줍니다. T – 세포 막의 형광 강도 CFSE 모든 세포 분열의 예와 stoichiometrically 감소하게된다. 모든 부서를. 폐 MSC, APC의 면전에서 + / – OVA, CD40 양성 이펙터 T 세포는 (붉은 동그라미) 확산의 부족을 나타냅니다 CFSE 강도에 큰 변화를 입증하지 않습니다.