Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Deney genel şeması Şekil. 1. 1. Reaktif Hazırlama Lütfen aşağıdaki grafiğe göre, 100 ml cam şişe taban orta (burada PB1 olarak bilinen) olun: MW mM mg/100 NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 .12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 <td> Glikoz 180,2 5,56 100,0 Na piruvat 110 0,33 3,6 CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2 Penisilin G 6.0 (yaklaşık) Ficoll-sakkaroz (FS) çözümü: 14 ml, 50 ml tüp PB1 çözüm için aşağıdaki kimyasallar ekleyin. Ficoll 70 6.0 g Sakaroz 3.424 g BSA 42.0 mg Ficoll 70 PB1 çözüm sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın ve iyice çalkalayınız. BSA, üzerinde tam bir çözülme kontrol ettikten sonra, çözüm yüzey eklemek ve bunu tutmakBSA kadar 4oC tamamen çözülmüş (> 4 saat veya gece boyunca). 50 ml tüp dengeleme çözümü (EFS20) ve vitrifikasyon solüsyonu (EFS40): EFS20:% 20 (v / v) etilen glikol,% 24 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.4 mol / L sakkaroz EFS40:% 40 (v / v) etilen glikol,% 18 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.3 mol / L * sakaroz * BALB / c veya ICR gerginlik embriyolarında 6 cryodamage daha duyarlıdır, çünkü, 0.9 mol / L sakkaroz sakaroz konsantrasyonu artırır. EFS20 çözüm EFS40 çözüm Etilen glikol 1 ml 2 ml FS çözüm 4 ml 3 ml Filtrasyon ile 0.45 mikron filte kullanarak çözüm sterilizer. 4, 5 ml polistiren tüpleri ve mağaza alikotları olun ° C Bunlar yaklaşık 6 ay için kullanılabilir. 0.75 M sakkaroz (TS1) içeren embriyo çözülme çözüm hazırlanması PB1 7.7 g sakaroz (adım 1.1 hazırlanan) çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. 90 mg BSA çözüm yüzey üzerine ekleyin ve tamamen eriyene kadar stand it bırakın. Çözüm filtrasyon ile sterilize edin. 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. Not: TS1, aynı zamanda piyasada bulunan M2 hazırlanmış olabilir. 7.7 g sakaroz M2 çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. Çözüm filtrasyon ile sterilize edin. 4oC kısım ve saklayın. Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. TS2 (çözülme çözüm: 0.25 M sukroz) içeren Uygun olarak, PB1 veya M2 20 ml hacmi 10 ml TS1 seyreltilir. 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. 2. 2-hücre Mouse Embriyolar, Vitrifikasyon Doğal çiftleşme ya da in vitro fertilizasyon teknikleri geleneksel 2-hücreli fare embriyoları hazırlayın. Kısım cryotube içine 50 ul EFS40. Bundan sonra, oda sıcaklığında vitrifikasyon prosedürünün geri kalanını gerçekleştirmek. EFS20 35 mm veya 60 mm plastik Petri kabı alt kısım 50 ul. Kültür ortamı sadece minimum miktarda kılcal bir bardak kullanarak EFS20 30 embriyolar aktarın. 2 dakika için bir zamanlayıcı başlayın. Not: embriyolar açılan alt yerleştirin. Bu embriyoların verimli dehidratasyon yapar. Stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin. Şekil olarak Susuz embriyolar çekmiş, bir morfoloji göstermektedir. 2A.Onlar yeterince kurutulmuş değilseniz, 1 veya 2 dakika bekleyin. Yaklaşık 1,5 dakika, çözümün sadece asgari miktarı ile EFS20 damla embriyolar pick up. Adım 2.1 'de hazırlanan cryotube EFS40 aktarabilirsiniz. Not: En iyi sonuç için, tüm embriyolar yaklaşık 2 dakika EFS40 aktarılır, böylece embriyolar toplayıp zamanlamasını ayarlayın. 1 dakika bekleyin. Cryotube doğrudan sıvı azot (LN 2) içine koyun. 3. Vitrifiye 2-hücreli Fare Embriyolar Çözülme Çözülme önce, kurtarılan embriyolar embriyo kültür ortamı 10 ul damla (3.13 adım) bir yemek hazırlayın. CO 2 inkübatör petrol ve yer ile çanak kullanana kadar örtün. Not: Bu deneyde kullanılan rutin embriyo kültürü için herhangi bir ortam olsa da, M16 orta gibi yüksek ozmolarite medya önermektedir. 37 ° C'ye kadar TS1 Sıcak Bir yüz maskesi ve cryogloves koyun. LN 2 t açınank ve embriyoları içeren bir cryotube almak. Tüpün üst hızla açmak ve LN 2 atın. Sonraki aşamada dondurma TS1 önlemek için 30 saniye bekleyin. Tüpe TS1 850 ul (37 ° C) ekleyin ve çözüm eşit eriyene kadar nazik pipettings (25 saniye içinde on kat) tarafından çözüm karıştırmak için bir 1000ul pipet kullanın. , Plastik bir 60 mm Petri kabında (ya da bir saat camı) (Şekil 3A) tüp tüm hacim aktarın . Not: Adım 3.14 CO 2 inkübatör yerleşene kadar Embriyolar oda sıcaklığında (22-25 ° C) ele alınmalıdır. 3 dakika süreyle bir zamanlayıcı başlayın. Embriyoları içeren orta çanak (Şekil 3B) yüzeyine yayılmış kadar çanak TS1 yaklaşık 2 dakika, hafifçe sallayın. Not: Bu TS1 için transfer yüzeyine yakın yüzen embriyolar nedeniyle dibe yardımcı olacaktır. Th üzerine üç 50 ul TS2 damla koyune kap (Şekil 3C). TS1 3 dakika sonra, bir stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin, onlar biraz çekmiş olmalı. TS1 önceki embriyo morfolojisi (Şekil 2B) ve daha sonra (Şekil 2C). Not: embriyoların hala şiş, 3 dk ile 1 TS1 içinde saklayın. Embriyoların Pick up ve TS2 ilk damla (Şekil 3D) aktarabilirsiniz. 3 dk için Sayacı başlat 3 dakika sonra, üçüncü bir damla (Şekil 3E) sonra ikinci damlasına kadar embriyo transferine ve . Adım 3.1 hazırlanan kültür ortamı embriyoların transferi. Embriyolar Şekil şeklinde. 2D. CO 2 inkübatör yerleştirin çanak. Yaklaşık 10 dakika sonra, TS2 yapılmıştır sakaroz yıkamak için kültür ortamı sonraki düşüş embriyo transferi. Embriyo transferi kadar CO2 inkübatör kültür devam edin. Not: Transferi Embryçözülme, gün alıcı kadın siyon hatası os. , In vitro Uzun kültür farelerin bazı suşları embriyo canlılığı azalabilir . 4. Temsilcisi Sonuçlar: Çözülme Tablo 1 ve 2'de sunulmuştur ve in vivo embriyo geliştirme sonra In vitro. Bu protokolün avantajları, farelerde farklı suşları çözülme ve geniş uygulanabilirliği sonra embriyoların yüksek beka. Gerginlik Toplam tüpler Sayısı Vitrifiye embriyoların sayısı Kurtarılan (No (%)) Morfolojik olarak normal (No (%)) Blastosist geliştirme (No (%)) C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87) BALB / CA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84) ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90) Tablo 1, ortak fare suşlarının vitrifiye çözülmüş embriyoların in vitro- geliştirme Embriyoların Durumu Alıcı kadın sayısı Embriyoların No transfer İmplantasyonu siteleri (No (%)) Canlı yavrular (No (%)) Taze 12 180 141 (78.3) 110 (61.1) Vitrifiye 16 242 202 (83.5) 125 (51.7) (Tablo 2). C57BL/6J farelerde vitrifiye çözülmüş embriyoların in vivo- geliştirme. Şekil 1Deney dengeleme, vitrifikasyon ve embriyo çözülme de dahil olmak üzere genel şeması. Şekil 2 çözülme her aşamada embriyo morfolojisi. Şekil 3 embriyo prosedür Eritme. Tüm işlemler, oda sıcaklığında yapılır. (A) cryotube TS1 (37 ° C) 850 ul ekleyin ve bir plastik tabak üzerine cryotube çözümün tüm hacim transferi. Şu anda, embriyoların Şekil gösterildiği gibi şişmiş bekliyoruz. 2B. (B), çanak yüzey üzerinde yavaşça sallayarak Spread çözüm. (C) üç 50 ul damla TS2, plastik tabak yerleştirin. (D), TS2 ilk damlasına kadar embriyolar transfer. Şekil olarak 3 dakika sonra, embriyolar shurunken bekliyoruz. 2C. (E), onları seri transferKalan TS2 içine ly sonra kültür ortamına düşer ve.