에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

실험의 전체 구조는 그림에 표시됩니다. 1. 1. 시약 준비 아래의 다음과 같은 차트에 따라 100 ML 유리 병의 기본 매체 (여기에 PB1라고도 함) 확인 : MW MM mg/100ml NaCl 58.4 136.98 800.0 KCl 74.6 2.68 20.0 KH 2 PO 4 136.1 1.47 20.0 나이 HPO 4 0.12 H 2 O 358.14 8.04 288.1 MgCl 2 6H 2 O 203.3 0.49 10.0 <tD> 포도당 180.2 5.56 100.0 나의 pyruvate 110 0.33 3.6 CaCl 2, 2 시간 2 O 147 0.9 13.2 페니실린 G 6.0 (약) Ficoll – 자당 (FS) 솔루션을 확인하십시오 : 50 ML 관에서 PB1 용액 14 ML 다음 화학 물질을 추가합니다. Ficoll 70 6.0 g 자당 3.424 g BSA 42.0 MG Ficoll 70 PB1 솔루션에 자당를 섞어 완전히 해산 때까지 잘 흔들. 위의 완전한 해체를 확인 후, 용액의 표면에 BSA를 추가하고 그것을에서 보관BSA까지 4oC 완전히 (> 4 시간 또는 야간) 해산입니다. 50 ML 튜브의 평균 솔루션 (EFS20)과 vitrification 솔루션 (EFS40)를 확인합니다 : EFS20 :​​ 20 % (V / V) 에틸렌 글리콜, 24 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1에 0.4 몰 / L 자당 EFS40 : 40 % (V / V) 에틸렌 글리콜 18 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1 0.3 몰 / L * 자당 그들은 6 cryodamage에 더 민감한 때문에 * BALB / C 또는 ICR 변형에서 배아의, 0.9 몰 / L 자당으로 자당의 농도를 증가시킵니다. EFS20 솔루션 EFS40 솔루션 에틸렌 글리콜 한 ML 이 ML FS 솔루션 4 ML 3 ML 0.45 μm의의 filte를 사용하여 여과하여 솔루션을 소독R. 4에서 5 ML 폴리스티렌 튜브 및 저장소에 aliquots 만들기 ° C. 그들은 약 6 개월 동안 사용할 수 있습니다. 0.75 M의 자당 (TS1)이있는 배아 해동 솔루션의 준비 PB1에서 자당의 7.7 g을 (단계 1.1에서 준비) 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다. 표면 솔루션에 BSA의 90 밀리그램을 추가하고 완전히 용해 때까지 서 두십시오. 여과하여 솔루션을 소독. 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. 참고 : TS1도 상용 M2에서 준비하실 수 있습니다. M2에서 자당의 7.7 g을 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다. 여과하여 솔루션을 소독. 4oC에서 나누어지는하고 저장합니다. 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. TS2 (해동 솔루션: 0.25 M의 자당)이있는 적절하게, PB1 또는 M2 20 ML 볼륨 10 ML TS1을 희석. 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. 2. 2 셀 마우스 태아의 Vitrification 자연 교배 또는 체외 수정의 기법에 의해 기존의 2 셀 마우스 배아를 준비합니다. 나누어지는 cryotube에 50 μl EFS40. 향후, 실온에서 vitrification 절차의 나머지 부분을 수행합니다. 35mm 또는 60mm 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 EFS20의 나누어지는 50 μl. 문화 매체에만 최소 금액과 모세관 유리를 사용하여 EFS20 30 배아까지 전송합니다. 2 분 타이머를 시작합니다. 참고 : 드롭의 하단에있는 장소의 배아. 이것은 배아의 효율적인 탈수를합니다. stereomicroscope에 의한 배아의 형태를 확인합니다. 그림과 같이 탈수 배아는 수축된 형태를 보여줍니다. 2A.그들은 충분히 건조되지 않은 경우, 1 개 또는 2 분 기다립니다. 1.5 분, 솔루션만을 최소한의 금액으로 EFS20 드롭에서 배아를 선택하십시오. 단계 2.1 준비 cryotube에 EFS40에게 전송합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 모든 배아가 약 2 분 EFS40로 전송할 수 있도록 배아를 수확의 타이밍을 조정합니다. 1 분 기다립니다. 액체 질소 (후면 2)에 직접 cryotube 놔. 3. Vitrified 2 셀 마우스 배아를 해동 해동하기 전에 복구 배아의 배아 배지 10 μl 방울 (3.13 단계 참조)와 요리를 준비합니다. 사용까지 CO 2 배양기에서 석유와 장소 접시를 커버. 참고 : 일상적인 배아의 문화에 대한 미디어가이 실험에 사용될 수 있지만, 우리는 이러한 M16 매체로서 높은 osmolarity와 미디어를 권해드립니다. 37 ° C.에 TS1을 따뜻하게 얼굴 마스크와 cryogloves 쓰세요. 에선 2t을 엽니다ank와 배아를 포함하는 cryotube를 검색할 수 있습니다. 신속하게 튜브의 상단을 열고 에선 2 폐기. 다음 단계에서 동결에서 TS1을 방지하기 위해 30 초 기다립니다. 튜브에 TS1의 850 μl (37 ° C)를 추가하고 솔루션을 고르게 해산 때까지 부드러운 pipettings (25 초 쯤 배)의 솔루션을 혼합하는 1000ul 피펫을 사용합니다. 플라스틱 60mm 페트리 접시 (또는 시계 유리) (그림 3A)에 관의 전체 볼륨을 전송합니다. 참고 :이 단계에서 3.14 CO 2 배양기에 배치되기 전까지는 태아가 실내 온도 (22-25 ° C)에서 처리되어야합니다. 3 분 타이머를 시작합니다. 배아를 포함하는 매체가 접시의 표면 (그림 3B)에 걸쳐 때까지 TS1 2 분 주변에 부드럽게 요리를 흔들. 참고 :이 TS1에게 양도 때 그들이 표면 근처에 떠 있기 때문에 태아가 아래 아래로 내려가서 도움이 될 것입니다. 일에 TS2 세 50 μl 방울을 넣고E 요리 (그림 3C). TS1 3 분 후 stereomicroscope에 의해 태아의 형태를 확인, 그들은 약간 수축된해야합니다. TS1의 앞부분에서 태아의 형태 (그림 2B)를 참조하고 나중에 (그림 2C). 참고 : 배아가 계속 부어있다면, 3 분 1 이상을 TS1에 보관하십시오. 배아를 들고 TS2의 첫 번째 드롭 (그림 3D)에게 전송할 수 있습니다. 3 분 타이머를 시작합니다 3 분 후, 세 번째 드롭 (그림 3E)에 다음 두 번째 드롭에 배아를 전송합니다. 3.1 단계에서 준비한 문화 매체에 배아를 전송합니다. 배아는 그림에 표시되는 모양입니다. 2D. CO 2 배양기에 넣어 요리. 약 10 분 후, TS2에서 이월되어 자당을 씻어 문화 매체의 다음 드롭 배아를 전송할 수 있습니다. 배아 전송까지 CO2 배양기에서 문화를 계속합니다. 참고 : 전송 엠브리해동 당일받는 여성의 oviducts에 OS. 체외에서 오랜 문화는 생쥐의 일부 변종에 태아의 가능성이 저하될 수 있습니다. 4. 대표 결과 : 해동은 표 1과 2에 표시하고 배아의 생체내 개발 이후 – 체외에서. 이 프로토콜의 장점은 생쥐의 다양한 변종에 해동하고 광범위한 적용 후 태아의 높은 survivability 수 있습니다. 변형 튜브의 총 번호 vitrified 배아 개 복구된 (번호 (%)) Morphologically 정상 (번호 (%)) blastocysts로 개발 (제 (%)) C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87) BALB / CA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84) ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90) 표 1. 일반적인 마우스 종자에 vitrified – 해동 배아의 체외 개발에 배아의 상태 받는 여성의 번호 배아의 번호 전송 주입 사이트 (번호 (%)) (번호 (%)) 새끼 라이브 신선한 12 180 141 (78.3) 110 (61.1) Vitrified 16 242 202 (83.5) 125 (51.7) 표 2. C57BL/6J 마우스에 vitrified – 해동 배아의 생체내 개발에. 그림 1. 평균, vitrification 및 배아의 융해를 포함하여 실험의 전반적인 체계. 그림 2. 해동의 각 단계에서 배아의 형태. 그림 3. 배아의 절차를 해동. 모든 절차는 실온에서 수행됩니다. (A), cryotube에 TS1 (37 ° C)의 850 μl를 추가하고 플라스틱 접시에 cryotube에있는 솔루션의 전체 볼륨을 전송합니다. 이때 태아는 같은 그림에 표시된 부었습니다. 2B. (B), 부드러운 흔들림으로 접시의 표면에 걸쳐 솔루션을 펴. (C), 플라스틱 접시에 TS2 세 50 μl 방울을 넣으십시오. (D), TS2의 첫 번째 드롭에 배아를 전송합니다. 그림과 같이 3 분 후, 배아는 shurunken보세요. 2C. (E), 그들은 직렬 전송나머지 TS2로 니는 문화 매체 후 방울합니다.