Vi beskriver en multiplex PCR för snabb detektion av Salmonella enterica serotyper Enteritidis, Hadar, Heidelberg, och typhimurium. Särskilda Salmonella serotyper kan identifieras genom att rikta en multiplex PCR till gener och sekvenser som är unika för O-antigen biosyntes kluster och flagellin av en viss serovar. Serovar tilldelas sedan till en Salmonella isolera baserad på uppkomsten av specifika, storlek amplicons (PCR-produkt) som motsvarar målet allel.
Nuvarande kommersiella PCR test för att identifiera gener salmonella mål unikt för detta släkte. Men det finns två arter, sex underarter, och över 2500 olika serotyper av Salmonella, och inte alla är lika i sin betydelse för folkhälsan. Till exempel att hitta S. enterica underarter IIIa Arizona på ett bord ägg lager gården är obetydlig jämfört med isolering av S. enterica underarter Jag serovar Enteritidis, den ledande orsaken av salmonella kopplade till konsumtionen av konsumtionsägg. Serotyper identifieras utifrån den antigena skillnader i lipopolysackarid (LPS) (O-antigen) och flagellin (H1 och H2 antigener). Dessa antigen skillnader är utseende av mångfalden av gener och alleler gen i samband med denna fenotyp.
Vi har utvecklat en allelotyping, multiplex-PCR som tangenterna på genetiska skillnader mellan fyra stora S. enterica underart jag serotyper som finns i fjäderfä och associeras med signifikant sjukdom hos människor i USA. PCR primerpar riktade till viktiga gener eller sekvenser som är unika för en specifik Salmonella serovar och utformats för att producera en amplicon med storlek specifika för den gen eller allel. Tilldelas en isolera bygger på en kombination av PCR-test resultat för specifika LPS Salmonella serovar och flagellin gen alleler. Den multiplex PCR beskrivs i denna artikel är specifika för detektion av S. enterica underarter Jag serotyper Enteritidis, Hadar, Heidelberg, och typhimurium.
Här visar vi hur du använder multiplex-PCR för att identifiera serovar för salmonella isolat.
De flesta kommersiellt tillgängliga PCR-test för upptäckt av Salmonella mål gener som är unika för släktet (ex. Inva). Men inte alla Salmonella är lika i sin förmåga att orsaka sjukdom hos människor eller förekomsten i djurpopulationer. Tidig upptäckt av antigena olikheter i Salmonella LPS O-antigen och flagellinH1 och H2-antigener har lett till differentieringen av Salmonella i över 2.500 serotyper baserat på dessa antigena skillnader. Det finns 46 olika O-antigener och 86 distinkta flagellin (H) antigen som identifierats i släktet Salmonella. Salmonella kan ha en (H1) eller två olika (H1 & H2) flagellins. De olika kombinationer av O, H1 och H2 antigener konto för 2500 Salmonella serotyper igen idag. En serovar tilldelas baseras på antigena formel härrör från identifiering av enskilda O och H antigener. De antigena formel skrivs som O: H1: H2, och där – hänvisar till frånvaron av H1 eller H2 flagellin och "NT" (icke-typningsbara) för Salmonella negativt för O-antigen, "". Till exempel är det serovar Typhimurium tilldelats ett S. enterica isolera med antigena formel B: I: 1,2, medan Enteritidis ges till ett isolat med formeln D1: G, M: -. Detta antigen variation i Salmonella befolkningen är den yttre manifestationen av skillnader på nukleotid nivå som därför lätt kan utnyttjas av PCR.
Vi har identifierat de genetiska skillnaderna är förknippade med specifika O och H alleler för att utveckla en allelotyping PCR för att identifiera S. enterica serotyper: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, och Typhimurium (3). Den riktiga uppdrag och rapportering av Salmonella serovar kräver testning för alla alleler i samband med O: H1: H2 antigen formler för Enteritidis (D1: G, M: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B : R: 1,2), och Typhimurium (B: I: 1,2). Utan kunskap om O-allel eller antigen, konstaterandet av H1 g, inte m allel ensamt inte nödvändigtvis identifiera Salmonella isoleras så Enteritidis som andra Salmonella serotyper: Agona, Kalifornien, och Montevideo, också har samma allel. Medan allelotyping PCR var ursprungligen avsedd att upptäcka i förgrunden nämns Salmonella serotyper, kan detta test identifiera ytterligare 19 serotyper (tabell 3). Vår allelotyping PCR var ursprungligen avsedd att upptäcka O och H alleler. I praktiken har det blivit mer praktiskt och kostnadseffektivt för oss att identifiera O-antigen genom att glida agglutinationstest, med hjälp av O-specifika immunsera, istället för att genomföra O allelotyping PCR när man arbetar med isolerade Salmonella kulturer. Däremot rekommenderar vi att du använder O allelotyping PCR om ditt labb använder denna PCR som en skärm (2) eller för att skriva salmonella-isolat in på FTA-kort (6), och inkluderar en Salmonella-specifika PCR med första skärmen av prover (4 ). Begränsa allelotyping PCR till endast de prover som identifierats som salmonella med PCR eller biokemiska / antigena tester.
Protokollet beskrivs i denna artikel har optimerats för användning med Idaho Technology Rapidcycler, en hetluft termocykler som gör att man kan skala ner reaktion volymer och driver reaktionsbetingelserna på kortare tid än många thermocyclers värmeblock. Att anpassa detta protokoll för användning med en värmeblock termocykler kan kräva att optimera reaktionsbetingelser empiriskt genom att sänka / höja glödgning temperaturer, justering av grundfärg koncentrationer, eller justera MgCl 2 koncentrationer. Till exempel har vi varit tvungna att anpassa protokollet för MJ Research PTC-200 termocykler enligt följande. Arbeta med samma reaktion volymer som beskrivs i tabell 1, arbetsmiljö beståndet concentrationof I primer som späddes till 2,5 mikroM var glödgning temperaturen sänks från 55 ° C till 45 ° C och inkubationstiderna vid denaturering, hybridisering och utbyggnad steg förlängdes till 20 s för I / G, M allelotyping PCR. Efter att ha lämpliga positiva och negativa kontroller är viktiga i den inledande start och optimering för PCR, inklusive offentliggjord protokoll. Vi rekommenderar att förvärva känd Salmonella serotyper, särskilt Anatum (E1: e, h: 1,6), enteritidis (D1: G, M: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: G, M, S: 1,2,7) och Typhimurium (B: I: 1,2), och ett laboratorium Escherichia coli K12 stam (DH5α, LE393, JM109 etc. ) som positiva och negativa kontroller respektive för allelotyping PCR-test som beskrivs i denna artikel. Flera av dessa Salmonella serotyper kommer att fungera som antingen positiva eller negativa kontroller, beroende på vilken allelen testas.
Vissa försiktighetsåtgärder och riktlinjer måste följas när de utför denna och annan diagnostik PCR. Först den fysiska separationenav mall förberedelser, PCR-och gelelektrofores är avgörande för att förhindra eventuella PCR överföring förorening och felaktig rapportering av falskt positiva. Dessutom är införandet av lämpliga kontroller som krävs i varje rutin PCR eftersom dessa kontroller identifiera problem som kan uppstå och hjälpa till med tolkning av resultat (5). Viktigast är konsekvent viktigt, särskilt med avseende på den genom elektrofores förutsättningarna för amplicon (PCR-produkten) upptäckt andestimation av amplicon storlek. För att illustrera detta, upphängda vi medvetet elektrofores tidigare än planerat i Figur 1A. Den molekylvikt standarder (körfält 1 och 13) och en positiv kontroll (Lane 2) inte är tillräckligt åtskilda att exakt uppskatta storlekar eller observera separation av DNA-fragment där det finns små skillnader (~ 50 bp) i storlek. Tillräcklig åtskillnad av DNA-fragment, särskilt molekylvikt standarder är avgörande då rapporteringen positiva är beroende av korrekt uppskattning av amplicon storlek och skilja "sant positiva" från icke-specifik amplicons som ibland observeras i den dagliga driften av PCR (5 ). Till exempel finns det en icke-specifik amplicon i figur 1B, körfält 7 (~ 700 bp i storlek). Hade elektrofores avbrutits för tidigt, då färgen fronten var först vid halv sätt punkt i agarosgel, skulle det vara lite skillnad mellan 500 bp och 700 bp fragment DNA. Därför skulle prov på bana 7 har felaktigt redovisats som positiv för både jag och G, M alleler.
Slutligen måste man inse de begränsningar som är förknippade med någon test. Flera av de H1/H2 allelotyping PCR har inte diskriminerande makt att urskilja subtila genetiska skillnader i alleler som hör till H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 antigen komplex, e, n, x / e , n, Z15 antigen komplex och H1 G-antigen komplex, vilket inkluderar G, M allel. En eller två aminosyror förändringar står för olika epitoper förekommer i dessa flagellar antigener. Det var därför svårt för oss att designa primers som kan utnyttja dessa ibland enda skillnader baspar i flagellin gensekvens (3). Till exempel Salmonella serotyper Dublin (D1: g, tfn: -) och Berta (D1: F, G, T: -) är PCR-positiva med våra g, mallelotyping grundfärger. H2 allelotyping grundfärg kan inte skilja Typhimurium (B: I: 1,2) från Lagos (B: I: 1,5), Heidelberg (B: R: 1,2) från Bradford (B: R: 1,5), Winneba (B: R: 1,6), eller Remo (B: R: 1,7), eller Hadar (C2: Z10: e, n, x) från Glostrup (C2: Z10: e, n, Z15). Även sannolikheten för att möta några av dessa serotyper: Lagos, Bradford, Winneba, Remo eller Glustrup är avlägset, det är en möjlighet och kräver antingen att ge disclaimer om testerna "begränsning eller annan bekräftande test.
Sammanfattningsvis identifierar denna PCR-baserad serotypning snabbt S. enterica serotyper Enteritidis, Hadar, Heidelberg och typhimurium och O, H1 och H2 alleler i samband med 19 ytterligare serotyper. Denna analys är en snabb, kostnadseffektivt alternativ till traditionell mikrobiologisk metod för serotypning salmonella.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har stötts av USDA Grants 1999-35212-8680, 2005-01.378 och 2010-04288-01, USDA Formel fonder och staten Georgiens veterinärmedicin jordbruksforskning Grant. Protokollet beskrivs i denna publikation har utvecklats för att användas av studenter som en del av riktad forskning kurser: MIBO 4900L, Gene 4960H, BCMB 4960L och Biol 4960H vid University of Georgia och användas av eleverna på flera molekylära projekt epidemiologisk forskning i Maurer laboratorium. Vi vill tacka de många studerande som har utfört forskning inom Maurer och Lee laboratorier, och vår avdelning stol, John Glisson för att stödja våra ansträngningar för att integrera grundutbildning undervisning med forskning.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Luria Bertani | Fisher | (or any comparable source) | ||
Microfuge tubes | 1.5 ml capacity | Fisher | (or any comparable source) | |
Ethanol | 200 proof | Fisher | (or any comparable source) | |
dH2O | Molecular Biology Grade | Sigma | (or any comparable source; PCR only) | |
10 x PCR Buffer: | 20 mM MgCl2 | Idaho Technology | (buffer comes with BSA, Ficoll and Tartrazine) | |
30 mM MgCl2 | ||||
40 mM MgCl2 | ||||
PCR primers | ||||
DMSO | ||||
dNTP | Roche | (or any comparable source) | ||
Taq DNA Polymerase | Denville | (or any comparable source) | ||
Capillary pipettes | 10 μl volume | Idaho Technology | ||
Rapid Cycler | Idaho Technology | |||
Agarose | Low EEO; Molecular Biology Grade | BioRad | (or any comparable source) | |
50 X TAE Buffer or 5X TBE Buffer | Fisher | (or any comparable source) | ||
Ethidium bromide | BioRad | (or any comparable source) | ||
Horizontal, submersible gel electrophoresis chamber with gel mold | BioRad | (or any comparable source) | ||
Power supply | BioRad | (or any comparable source) | ||
Molecular Imager Gel Doc System | BioRad | (or any comparable source) |
Table 4. Materials