Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Allgemeine Empfehlungen Menschliches Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBEC-5i) Kultur wurde bereits in 6 beschrieben, 8. P. falciparum Parasiten wurden in 9 kultiviert. Beide HBEC-5i und P. falciparum Parasiten Kulturen sollten in sterile Bedingungen zu jeder Zeit eingehalten werden. Alle Reagenzien sollten bei 37 ° C vorgewärmt werden Wir empfehlen, regelmäßig auf Mykoplasmen-Kontaminationen 10 durch PCR (Minevera Biolabs, folgt den Anweisungen des Herstellers) zu überprüfen. Das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst. 1. Endothelzellen Routine Kultur Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien. Medium zur Vorbereitung Reagenzien Menge "DMEM unvollständig" DMEM-F12 Ham 500ml &nbsp; L-Glutamin 200 mM 5ml Penicillin / Streptomycin 100X 5 ml NaOH 1M 1,3 ml (pH-Wert auf 7,4) "DMEM complete" "DMEM unvollständig" 450ml Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem 50ml Endothelzellwachstum ergänzen 5 ml Kultur HBEC-5i in einem belüfteten 25cm 2-Kolben mit 10ml DMEM Vollmedium in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Passage-Zellen, wenn sie konfluent geworden. Entfernen Sie das alte Medium abgesaugt und waschen zweimal mit DMEM unvollständige mittel-oder Gewebekulturen grade PBS (Ca 2 + und Mg 2 + frei) bis 37 vorgewärmten ° C. Add 1 ml vorgewärmten VersuchenPSIN-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA), schwenken, um die Gesamtheit der Kolben abdecken und inkubieren ~ 2 min bei 37 ° C. Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass mindestens 90% der Zellen wurden abgelöst. Wenn nötig, vorsichtig klopfen den Boden des Kolbens auf adhärente Zellen zu entfernen. Fügen Sie 10 ml DMEM Vollmedium, um das Trypsin und Transfer Zellen in eine 15 ml konische Röhrchen zu blockieren. Zentrifuge für 4 min bei 300 g bei Raumtemperatur (RT). Überstand verwerfen und das Pellet mit 10 ml DMEM Vollmedium. Pipette die Lösung nach oben und unten gründlich resuspendieren. Fügen Sie 1 oder 2 ml der Zellsuspension in eine neue Kultur einwiegen und 8ml frischem Medium, um die Kultur aufrecht zu erhalten. Bewerten Kultur Wachstum jeden Tag unter einem inversen Mikroskop und ändern Medium alle 2 oder 3 Tage, bevor es gelb wird. 2. Vorbereitung Endothelzellen für eine Auswahl Zwei Tage vor dem Tag der selectio n, fügen Fibronektin in sterile PBS (2 g / cm 2) in einem (oder mehreren) 60 mm Petrischale verdünnt. Inkubieren Sie die Schale für 5 bis 20 min bei 37 ° C, dann entfernen Sie die Fibronektin-Lösung, die bei 4 ° C für einen Monat gespeichert werden und wieder einmal verwendet. Passage-Zellen wie in den Abschnitten 1.3 beschrieben. bis 1,5. Unter der Annahme, 100% konfluenten Zellen getrennt wurden und erneut in 10ml DMEM Vollmedium (Abschnitt 1.6., Mit einem äquivalenten Volumen Medium resuspendieren, wenn der Konfluenz niedriger ist, z. B. mit 8ml resuspendieren, wenn der Konfluenz betrug 80%), fügen Sie 1,5 ml der suspendierten Zellen, die Fibronektin beschichtete Petrischale und anderen 1,5 ml DMEM Vollmedium. Legen Sie die Samen Petrischale in den Brutschrank. Hinweis: Im Idealfall sollte die Konfluenz werden rund 90% zum Zeitpunkt der Auswahl zwei Tage später. Optional. So aktivieren Sie HBEC-5i, fügen Sie die TNF (Tumor Nekrose Faktor) Zytokin in einer Endkonzentration von 50μg/ml 24 Stunden vor der Wahl. e_title "> 3. Plasmodium falciparum Routine Kultur Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien (siehe Tabelle hier unter). Bereiten menschlichen roten Blutzellen (RBC) durch die Trennung von Vollblut (Gruppe O +) beim Durchgang durch ein Leukozytendepletionsfilter (siehe "Methoden in Malaria Research" Publikation 11 für allgemeine Malaria-Parasiten Kultivierung). Wash RBC zweimal durch Zentrifugieren bei 400 g für 5 min und Resuspendieren sie mit 10 ml RPMI unvollständig. Keep gewaschen RBC bei 4 ° C zu einer unvollständigen Medium bei 50% Hämatokrit. Medium zur Vorbereitung Reagenzien Menge "RPMI unvollständig" RPMI 1640 (mit Bicarbonat) 500ml Hepes 1M 12.5ml Glucose 20% 5ml </td> L-Glutamin 200 mM 5ml Gentamycin 50mg/ml 250μl NaOH 1M 0,7 ml (pH-Wert auf 7,2) "RPMI komplett" "RPMI unvollständig" 450ml Pooled Menschen (nicht-immunen) Serum 50ml Kultur P. falciparum infiziert RBC mit RPMI Vollmedium mit 2% Hämatokrit und bei 37 ° C mit 3% CO 2, 1% O 2, und 96% N 2. Machen Giemsa Abstrich 11 tägliche auf die Stufe der Entwicklung des Parasiten (Abbildung 2) zu beurteilen. Regelmäßig (ca. einmal pro Woche) zu synchronisieren Kultur durch Sorbit Behandlung 12. Am Tag vor der Wahl Assay Ziel für einen Ring-Bühne Kultur bei 5% Parasitämie oder mehr (im Idealfall mindestens 10%). 4. Auswahl von P. falciparum für cytoadhesion an Endothelzellen Am Tag des Tests sollte der Parasit Kultur pigmentierte Trophozoiten Stufe (Abbildung 2) (im Idealfall 10% Parasitämie), während HBEC-5i Kultur sollte bei 50 bis 100% Konfluenz (im Idealfall 90%). 30μl Hämatokrits von Parasiten Kultur pro HBEC-5i Petrischale benötigt. Wash Parasiten zweimal durch Zentrifugieren (500 g für 5 min) 1,5 ml der Parasit Kultur. Überstand und resuspendieren mit 10 ml frisch zubereitet, erwärmt, DMEM unvollständige Medium. Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal. Resuspendieren 30μl Hämatokrits mit 1,5 ml DMEM unvollständig mit 1% BSA. Waschen Sie die HBEC-5i beschichtete Petrischale zweimal Absaugen Medium und das Hinzufügen von 3 ml DMEM unvollständig. Fügen Sie die Lösung von Parasiten, die HBEC-5i Gericht und bei 37 ° C für 75min. Resuspendieren Parasiten zweimal (nach 30 und 60 min) während der Inkubationdurch vorsichtiges Schwenken der Schale in die vier Richtungen, sowie im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn. Nach der Inkubation der Schale 5-mal durch Absaugen Medium, mit einem Kunststoff-Pasteurpipette bis 3 ml warmem DMEM unvollständige mittlere und sanfte Schaukeln hinzuzufügen. Wenn viele Gerichte benutzt werden, halten sie an einem warmen Oberfläche, wie eine große Flasche mit Wasser bei 37 ° C gefüllt Überprüfen Sie die Teller unter einem inversen Mikroskop. Wenn viele infizierte RBC noch sichtbar sind, nicht mehr wäscht, wie oben beschrieben. Handle der Petrischale sehr sorgfältig, um das Risiko einer Kontamination zu vermeiden. Entfernen Sie Medium aus der Schüssel und fügen 3ml warmes RPMI Vollmedium mit 40 ul Hämatokrits von frischen uRBC. Die Schale in einer luftdichten Kammer inkubiert, Gas für 3 min und Ort der Kammer in einem Brutschrank bei 37 ° C über Nacht. Am Tag danach Ernte der Parasiten durch Waschen mit RPMI unvollständige Medium, in ähnlicher Weise wie in Abschnitt 4.4 beschrieben. aber stärker. Keep alle verwendeten Medium (mit resuspendiert RBC) in einer 15 ml konische Röhrchen. Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass alle RBC aus der Schale entfernt worden sind. Pellet der Parasiten, den Überstand verwerfen, in 5ml RPMI Vollmedium und legen Sie die Mischung in einer Flasche für die normale Züchtung resuspendieren. 5. Repräsentative Ergebnisse Nicht ausgewählte Parasiten zeigen eine geringe Bindung an HBEC-5i (Abbildung 3A). So wird nach der ersten Runde der Auswahl wird nur sehr wenige Parasiten geerntet und es kann bis zu einem Monat der Kultivierung einer Parasitämie ausreichend für die zweite Auswahlrunde erreichen. Nach jeder Runde der Selektion, binden mehr und mehr Parasiten auf die Endothelzellen und die Auswahl kann in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden. Nach 4-5 Runden der Selektion, sind High-Bindung Parasitenpopulation erhalten (Abbildung 3). In unseren Händen, wurde die Bindung von HB3-HBEC zu HBEC-5i oder TNF aktiviert HBEC-5i von simIlar Ebene (Daten nicht gezeigt). Die hier beschriebene Protokoll wurde mit 4 P. getestet falciparum-Stämme: HB3, IT/FCR3, 3D7 und Dd2 (Tabelle 1). Nur die letztere erwies sich nicht in der Lage zu HBEC-5i zu binden, auch nach 5 Runden der Selektion. HB3 Parasiten wurden auch für cytoadherence Human Dermal und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC und HPMEC) ausgewählt. Nach 4 Runden der Selektion, mit der hier beschriebenen Methode wurde eine High-Bindung der Bevölkerung auf beiden HDMEC und HPMEC (Abbildung 4). Abbildung 1. Überblick über den Auswahlprozess. Abbildung 2. Entwicklungsstadien von P. falciparum infiziert rote Blutkörperchen. Giemsa-Abstrich unter dem Mikroskop sichtbar zu 1000x Vergrößerung. Abbildung 3. Typisches Beispiel von Parasiten Bindung an HBEC-5i. (A) Die blaue Schicht ist HBEC-5i fixiert mit Glutaraldehyd und mit Giemsa, visualisiert unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung. Die Bilder wurden aufgenommen, nachdem uRBC und ungebundenen iRBC weggespült wurden. Die linke Tafel zeigt ein einzelnes P. falciparum HB3 (nicht ausgewählt) Parasit HBEC-5i gebunden. Im rechten Bereich der HB3-HBEC Parasiten hatten für 5 Runden ausgewählt worden. (B) Daten stellt den Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt. Die Zahl der Parasiten pro Endothelzellen gebunden wurde gezählt. Tabelle 1. Zusammenfassung von Plasmodium falciparum-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HBEC-5i. Beachten Sie, dass HB3 auch auf TNF-aktivierten HB ausgewählt wurden ausgewähltEC-5i. Nach 5 Runden der Selektion zeigten die Dd2 Belastung keine Zunahme der Bindung an HBEC-5i im Vergleich zu unselektierten-Dd2. Abbildung 4. Bindung von P. falciparum HB3 Parasiten dermal (HDMEC) und Lungenembolien (HPMEC) Endothelzellen, vor und nach 4 Runden der Selektion. Obwohl der Nährboden für HDMEC und HPMEC leicht unterscheidet (siehe Anweisungen des Herstellers), wurde das Protokoll für die Auswahl identisch mit HBEC-5i. Pictures at 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare DMEM-F12 Ham Sigma D6421 Für DMEM Vollmedium L-Glutamin 200 mM GIBCO 25030 Für DMEM und RPMI Vollmedium Penicillin / Streptomycin 100X (10000 units / ml und 10mg/ml) ScienCell 0503 Für DMEM Vollmedium Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem ScienCell 0025 Für DMEM Vollmedium Trypsin-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA) ScienCell 0103 Endothelzellwachstum ergänzen ScienCell 1052 Für DMEM Vollmedium Gewebekultur behandelt 60 mm X 15 mm Petrischalen BD 353002 Humanem Fibronectin Millipore FC010 Verwenden Sie bei 2 g / cm 2 TNF R &D Systems 210-TA optional, bei 50 pg / ml Einsatz RPMI 1640 Lonza BE12-167f Für RPMI Vollmedium Gentamycin 50mg/ml Lonza 17-518Z Für RPMI Vollmedium Hepes 1M Lonza BE17-737E Für RPMI Vollmedium HDMEC ScienCell 2000 Primary-Zelllinie HPMEC ScienCell 3000 Primary-Zelllinie HBEC-5i Gewonnen aus Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) Tabelle 2. Materials