Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

1. Preparare un lavoro sicuro e sterile Avere familiarità con tutte le norme di laboratorio e le precauzioni di sicurezza da prendere quando si lavora con microrganismi. Indipendentemente dalla loro classificazione biohazard, tutti i materiali che entrano in contatto con microrganismi sono considerati rifiuti infetti e devono essere decontaminati prima dello smaltimento. Seguire le indicazioni di sicurezza in conformità con quelli forniti da investitori istituzionali di igiene ambientale e servizi di sicurezza, la creazione di contenitori adeguati per lo smaltimento dei rifiuti immediato e corretto di materiali potenzialmente contaminati (rischi biologici). Sterilizzare tutti gli strumenti, soluzioni e mezzi di comunicazione prima di utilizzarli per le procedure di placcatura. Sgombrare il campo da tutti i materiali che ingombrano l'area di lavoro sul banco di laboratorio. Pulire l'area di lavoro con un disinfettante per minimizzare la contaminazione possibile. Impostare un becco Bunsen e lavorare lentamente, con attenzione, e deliberatamente all'interno dell'area del campo sterile creato dal updraft della fiamma. Se si lavora con BSL-2 organismi, impostare il vostro spazio di lavoro in un armadio biosicurezza. Un becco Bunsen non può essere utilizzata all'interno del mobile perché il calore della fiamma interrompe il flusso d'aria essenziale per la sua funzionalità. Disporre tutte le forniture necessari per la procedura sul banco di laboratorio presso il campo sterile. Assicurarsi che tutti i materiali sono adeguatamente etichettati. Organizzare l'area di lavoro per massimizzare l'efficienza di lavoro ed evitare movimenti inutili ridurre al minimo il tempo di esposizione di materiali sperimentali ad inquinanti atmosferici. Posizionare il becco Bunsen a destra in panchina. Luogo piastre di agar o piatti di Petri alla vostra sinistra. Disporre colture cellulari, tubi, flaconi e bottiglie al centro del banco. Allentare i tappi di tubetti, flaconi e bottiglie in modo che possano essere facilmente aperto con una sola mano durante le manipolazioni successive. Lavare accuratamente le mani con sapone antisettico e caldol'acqua prima di maneggiare i microrganismi. 2. Streak Procedura Plate: isolamento di colonie batteriche tramite il metodo Quadrant La striscia piastra procedura è stata progettata per isolare le colture pure di batteri, o colonie, da popolazioni miste per semplice separazione meccanica. Colonie singole sono comprende milioni di cellule in crescita in un cluster su o all'interno di una piastra di agar (Figura 1). Una colonia, a differenza di una singola cella, è visibile ad occhio nudo. In teoria, tutte le celle di una colonia sono derivati ​​da un singolo batterio inizialmente depositato sulla piastra e quindi sono indicati come un clone, o gruppo di cellule geneticamente identici. I batteri presenti in una varietà di forme e dimensioni. Ad esempio, le singole cellule di Escherichia coli sono forma di asta con una lunghezza media di 2 um e larghezza di 0,5 micron mentre le cellule sono Streptococcus sferica con un diametro medio di 1 um. Alcuni batteri (such come E. coli) esistono come singole cellule, mentre altri formano distinte modalità di associazione. Streptococcus, per esempio, crescono in coppie o catene di forma o cluster di celle. Si ritiene generalmente che una singola colonia deriva da una singola cellula in fase di scissione binaria, tuttavia, questa ipotesi non è vero per quei batteri che naturalmente esistono come coppie, catene, o cluster o che dividono da altri meccanismi. In alternativa, se i batteri sono troppi placcato, poi si sovrappongono di cellule possono verificarsi e aumentare la probabilità di due o più batteri che danno luogo a quello che sembra essere una singola colonia. Per evitare queste complicazioni nella descrizione o enumerazione colture batteriche crescono su un mezzo solido, le colonie sono indicati come unità formanti colonia (cfu). Con la striscia-piastra procedura, una miscela di cellule è distribuita sulla superficie di un semi-solido, agar-based mezzo nutriente in una capsula Petri tale che sempre meno battericale cellule sono depositati in punti molto distanti sulla superficie del terreno e, dopo incubazione, si sviluppano in colonie. Il quadrante metodo per isolare singole colonie da una miscela di celle sarà descritto qui. Streak-placcatura può essere realizzato con un numero di strumenti diversi (Figura 2). Un anello metallico può essere riutilizzato più volte ed è utilizzata per i ceppi di routine striscia-placcatura laboratorio. Anelli di plastica usa e getta sono disponibili in commercio e vengono utilizzati più comunemente quando si lavora con BSL-2 ceppi in un armadio biosicurezza. Molti ricercatori preferiscono usare usa e getta, pre-sterilizzati bastoni di legno o stuzzicadenti piatte per streak-placcatura. Si tratta di un'alternativa economica alle reti di plastica monouso e può essere particolarmente utile quando si lavora con un campione ambientale come terreno che probabilmente contiene sporulazione. Monouso pre-sterilizzati bastoni e stuzzicadenti non devono essere fiammato con il bruciatore Bunsen Gios evitando inutili aerosol di batteri sporigeni e la contaminazione incrociata delle superfici di laboratorio o piastre di agar con spore. Etichetta attorno al bordo del fondo (non il coperchio) di una piastra di agar con almeno il nome, la data, il tipo di mezzo di crescita, e il tipo di microrganismo da piastrate su mezzo. Le piastre devono essere completamente asciutti, senza formazione di condensa sul coperchio e pre-riscaldato a temperatura ambiente prima di striscia-placcatura. Se le piastre vengono conservati a 4 ° C, rimuoverli diverse ore o anche il giorno prima. Stendere fuori in piccole pile scaglionati di non più di 2-3 piastre e lasciare asciugare. Il campione da cui la striscia-piastra sarà inoculato può essere sia una sospensione di cellule in brodo o una colonia esistente da un'altra piastra di agar. Per cominciare, si raccomanda un solo campione essere usata per inoculare una singola piastra. Per risparmiare tempo e materiali, una singola piastra può essere utilizzata per più samples ma solo una volta si diventa abile a striscio un campione su un piatto. Per il primo quadrante, il campione viene raccolto e si sviluppa su circa un quarto della superficie del terreno con un rapido, liscio, avanti e indietro movimento (Pannello A di figura 3). Sollevare la parte inferiore di una piastra capovolta dalla panchina. Spostare il ciclo, bastone, o stuzzicadenti avanti e indietro molte volte attraverso la superficie agar dal cerchio al centro della piastra. Se l'inoculo è una sospensione di cellule, ottenere un'ansa con un anello metallico o 5-10 microlitri con una micropipetta. Assicurati di turbolenza o vortice della sospensione cellulare prima di rimuovere un 'aliquota per la placcatura. Usare una tecnica asettica Durante questa fase, fiamma non solo il ciclo, ma anche il bordo della bottiglia o del tubo prima e dopo la rimozione l'inoculo. Inoltre, non toccare i lati del tubo o bottiglia con l'anello o canna del micropipettatore. Se pipettaggio l'inoculo, dispensare la sospensione cellulare sul appropriate posto sulla piastra quindi utilizzare uno, bastone loop o stuzzicadenti diffondere sopra il primo quadrante della piastra. Se l'inoculo è una colonia da un'altra piastra, toccare delicatamente la colonia con il ciclo, stick o stuzzicadenti poi si diffonde nel primo quadrante della piastra. Assicurarsi che l'anello metallico viene raffreddato prima di toccare la colonia. Per garantire il ciclo non è troppo caldo, toccare leggermente la piastra agar in una zona in cui non è striature si verificherà. Solo poche cellule sono necessarie dalla colonia, non l'intera colonia. Se si utilizza un anello metallico, fiamma utilizzando un becco Bunsen prima di ottenere l'inoculo per la piastra (pannello B di Figura 3). Avviare circa 3-4 pollici dal ciclo, con il filo nella punta del cono blu, la parte più calda della fiamma. Il metallo dovrebbe diventare incandescente. Spostare il filo in modo che la fiamma si avvicina il ciclo. Questa manipolazione impedisce aerosol di batteri lasciati sul ciclo dal precedente utilizzo. Flaming uccide l'batteri (anche se non le spore) e le correnti di convezione dall'aria riscaldata evitare che altri agenti inquinanti presenti nell'aria di depositarsi sul filo metallico durante le manipolazioni successive. Se si utilizza uno stuzzicadenti sterile piatta, tenere la parte più stretta delicatamente tra il pollice e l'anulare con un angolo di 10 a 20 ° al mezzo, e utilizzare l'estremità larga striscia per i quadranti. Se si utilizza un loop o bastone di legno, tenerla come una matita con la stessa angolazione. Non premere così forte che scava il ciclo, bastone o uno stuzzicadenti in agar. Dopo aver completato il primo quadrante, capovolgere e posò il piatto posteriore nel coperchio in panchina. Smaltire il bastone o uno stuzzicadenti o ri-fiamma l'anello metallico come descritto al punto # 4. Ruotare la piastra Petri 90 ° per strisciare il secondo quadrante. Sollevare la parte inferiore di una piastra capovolta dalla panchina quindi toccare il, bastone loop o stuzzicadenti al primo quadrante verso la fine della striscia precedente. Utilizzando il back-modello e indietro, attraversare la last mezzo delle strisce nel primo quadrante poi passare nel secondo quadrante vuoto. Capovolgere e scendere la piastra posteriore nel coperchio sul banco una volta che il secondo quadrante è riempito. Il ciclo, stick o uno stuzzicadenti non deve mai tornare nella prima metà degli striature nel primo quadrante in cui è stata depositata la maggior parte del inoculo originale. Un nuovo ciclo di plastica, bastone di legno o stuzzicadenti deve essere utilizzato per ciascun quadrante. Ripetere il passo # 6 due volte per il terzo e quarto quadrante. Assicurarsi di smaltire il bastone o uno stuzzicadenti o ri-fiamma l'anello metallico tra ogni quadrante. Evitare di entrare nel primo quadrante quando striature quarto quadrante. Incubare la piastra capovolta in modo condensa che si accumula sul coperchio non gocciola sulle colonie. 3. Versare Procedura Plate: Enumerazione delle cellule batteriche in un campione misto Questo metodo è spesso utilizzanod per contare il numero di microrganismi in un campione misto, che viene aggiunto a un terreno agar fuso prima della sua solidificazione. I risultati del processo nelle colonie uniformemente distribuiti su tutto il terreno solido quando la diluizione del campione adeguato è placcato. Questa tecnica viene utilizzata per eseguire conteggio delle piastre vitali, in cui viene enumerato il numero totale di unità formanti colonia all'interno agar e sulla superficie di agar su una singola piastra. Conteggio delle piastre vitali fornire scienziati un modo standardizzato per generare curve di crescita, per calcolare la concentrazione di cellule nel tubo da cui è stata placcata il campione, e per esaminare l'effetto di vari ambienti o condizioni di crescita sulla sopravvivenza delle cellule batteriche o tasso di crescita. Etichetta attorno al bordo del fondo (non il coperchio) di una piastra Petri sterile, ma vuoto con almeno il nome, la data, il tipo di mezzo di crescita, e il tipo di microrganismo da aggiungere al mezzo agar fuso. Includere il fattore di diluizione, se platIng diluizioni seriali, o una serie di diluizioni ripetute, che si traduce in una riduzione sistematica della concentrazione di cellule nel campione. Preparando diluizioni seriali è necessario se il numero di cellule nel campione supera la capacità della piastra di agar, in cui l'intervallo statisticamente significativa è 30-300 cfu. Se vi sono più di 300 CFU su un piatto, allora le colonie saranno affollato e sovrapposizione. Ottenere una provetta contenente 18 ml di agar fuso. Il mezzo agar devono essere distribuiti in provette e pre-sterilizzati in autoclave. Lo stesso giorno è necessaria per un esperimento, l'agar deve essere sciolto in un vapore per 30 minuti quindi trasferite a 55 ° C bagnomaria. Solo agar quanto è necessario per l'esperimento deve essere sciolto in quanto non può essere riutilizzato. Dieci minuti prima di versare piastre, i tubi di agar fuso deve essere trasferito dal 55 ° C a bagnomaria un blocco di calore sul lavoropanchina atory fissata a 48 ° C. Una volta che il agar raggiunge questa temperatura, è pronto per versare. Se l'agar è troppo caldo, i batteri nel campione può essere ucciso. Se l'agar è troppo freddo, il mezzo può essere grumoso, una volta solidificato. Ottenere il campione, che dovrebbe essere un brodo di coltura o di una sospensione di cellule prodotte da cellule di miscelazione di una colonia in buffer o soluzione salina. I campioni possono essere derivati ​​da una serie di diluizioni di un singolo campione. Volume del campione da rivestire deve essere compresa tra 0,1 e 1,0 ml. Aprire il coperchio della piastra di Petri vuota, e distribuire il campione nel centro della piastra (Pannello A di figura 4). Chiudere il coperchio. Usare una tecnica asettica durante tutta la procedura. Utilizzare una pipetta sierologica o micropipettatore di trasferire il campione alla piastra. Controllare il flusso del campione in modo che non schizzare della piastra. Togliere il tappo dalla vascae di agar fuso, e passa il bordo del tubo aperto attraverso la fiamma del bruciatore Bunsen. Aprire il coperchio della scatola di Petri contenente il campione e versare la agar in cura (gruppo B della figura 4). Chiudere il coperchio, quindi mescolare il campione con l'agar rimestando delicatamente la piastra. Lasciare solidificare l'agar accuratamente prima di invertire la piastra per l'incubazione. 4. Diffusione Procedura Plate: La formazione di colonie batteriche discreti per la conta su piastra, l'arricchimento, alla selezione o screening Questa tecnica è tipicamente usato per separare microrganismi contenuti in un volume piccolo campione, che si sviluppa sulla superficie di una piastra di agar, causando la formazione di colonie discrete distribuiti uniformemente sulla superficie agar quando la concentrazione appropriata di cellule è placcata. Oltre a utilizzare questa tecnica per conteggio delle piastre vitali, in cui il numero totale di unità formanti colonia su un singLe piastra viene enumerato e utilizzati per calcolare la concentrazione di cellule nel tubo da cui è stata placcata il campione, spread-placcatura viene normalmente utilizzato in esperimenti di arricchimento, selezione, e lo screening. Il risultato desiderato per questi tre esperimenti è generalmente la stessa per conteggio delle piastre, in cui una distribuzione di colonie discrete costituisce attraverso la superficie di agar. Tuttavia, l'obiettivo non è quello di garantire tutte le cellule formano colonie vitali. Invece, solo le cellule in una popolazione che hanno un particolare genotipo deve crescere. La procedura di piastra di diffusione può essere impiegato oltre la tecnica di colata piastra per un esperimento enumerazione se l'obiettivo finale è quello di isolare le colonie per ulteriori analisi, perché le colonie crescono accessibilmente sulla superficie dell'agar mentre sono ormai parte integrante della procedura di agar con la piastra di scorrimento. Ci sono due strategie descritti qui per la procedura piastra diffusione. Il primo (Metodo A) comporta l'uso di una piattaforma girevole e vetro o metallo rod a forma di mazza da hockey. Il secondo (Metodo B), denominato "Metodo Copacabana", comporta stringono presterilizzati perle di vetro. Sia rendere più agevole anche la diffusione delle cellule attraverso la superficie agar. Metodo A: Spread-placcatura con un giradischi e vetro o asta metallica Etichetta attorno al bordo del fondo (non il coperchio) di una piastra di agar con almeno il nome, la data, il tipo di mezzo di crescita, e il tipo di microrganismo da piastrate su mezzo. Comprendere il fattore di diluizione, se placcatura diluizioni seriali. Le piastre devono essere completamente asciutta senza condensazione sul coperchio e pre-riscaldata a temperatura ambiente prima di spread-placcatura. Se le piastre vengono conservati a 4 ° C, rimuoverli diverse ore o anche il giorno prima. Stendere fuori in piccole pile scaglionati di non più di 2-3 piastre e lasciare asciugare. Centrare il disco sul piatto (Figura 5). Ottenere sir campione, che dovrebbe essere un brodo di coltura o una sospensione di cellule prodotte da cellule miscelazione da una colonia in tampone o soluzione salina. I campioni possono essere derivati ​​da una serie di diluizioni di un singolo campione. Il volume del campione da rivestire deve essere compresa tra 0,1 e 0,2 ml. Aprire il coperchio della piastra Petri, e distribuire il campione sul centro della agar. Chiudere il coperchio. Usare una tecnica asettica durante tutta la procedura. Utilizzare un micropipettatore per trasferire il campione alla piastra. Controllare il flusso del campione in modo che non schizzare della piastra. Immergere la lastra di vetro o tondino metallico (anche chiamato spreader) in un becher di 70% (v / v) etanolo. ATTENZIONE: Non immergere una spatola calda in un bicchiere di alcol. L'etanolo deve toccare solamente la porzione di fondo della freccia e il primo pollice dello stelo. Scolare e accendere l'etanolo in eccesso facendolo passare attraverso la fiamma di un Bunsen bruciatore. La fiamma deve percorrere la lunghezza del diffusore e lo stelo che è venuto a contatto con l'etanolo poi rapidamente si spengono. Se il bicchiere del fuoco etanolo cattura, non fatevi prendere dal panico! Mettere un coperchio in vetro sopra il bicchiere, che presto spegnere il fuoco. Aprire il coperchio della piastra di agar, tenendo il coperchio con la mano sinistra con il pollice e l'indice. Raffreddare il divaricatore toccando al agar lungo il bordo vicino al cerchio. Non toccare l'agar-agar in cui sono stati aggiunti alle cellule. Lo spandiconcime calda uccidere le cellule. Con la mano sinistra (tenendo premuto il coperchio della piastra di agar), girare il giradischi lentamente. Anche se meglio evitare, se si deve mettere il coperchio verso il basso, mettere a faccia in giù su una superficie disinfettata all'interno del campo sterile del bruciatore Bunsen. Con un coperchio rivolto verso l'alto, vi è una maggiore possibilità di contaminazione da movimenti di oggetti o mani, creando correnti d'aria che causanomicrorganismi e particelle di polvere di scendere alla superficie interna del coperchio. Con la mano destra, tenere premuto il spreader delicatamente sulla superficie di agar e gradualmente estendere il campione in modo uniforme su tutta la piastra. Spostare la barra della freccia avanti e indietro su tutta la piastra, come il giradischi è in rotazione. Lasciare il campione di assorbire completamente (almeno 5 minuti) prima di invertire la piastra di incubazione. Metodo B: Spread-placcatura con perle di vetro: il "Metodo Copacabana" Etichetta attorno al bordo del fondo (non il coperchio) di una piastra di agar con almeno il nome, la data, il tipo di mezzo di crescita, e il tipo di microrganismo da piastrate su mezzo. Comprendere il fattore di diluizione, se placcatura diluizioni seriali. Aprire il coperchio della piastra di agar, tenendo il coperchio con la mano sinistra con il pollice e l'indice. Quindi aprire il tubo di vetro o una bottiglia contenente pre-sterilizzati glass perline. Con la mano destra, fiamma il bordo del tubo o bottiglia poi accuratamente erogare 10-12 microsfere di vetro sterili su una piastra di agar (Figura 6). Chiudere il coperchio della piastra, e fiamma il bordo del tubo o bottiglia nuovamente prima di sostituire il tappo e il suo annullamento. Versate delicatamente i grani dal tubo o bottiglia a pochi centimetri sopra il agar in modo che i talloni non rimbalzano fuori dalla capsula di Petri. Utilizzare perle di vetro pari a 4 mm di diametro. Sterilizzare in bottiglie di vetro o provette in autoclave a 121 ° C sul ciclo di asciugatura (impostazione di gravità) per 30 minuti. Un vantaggio di utilizzare perle invece di un diffusore che non è contenitori aperti di etanolo sono necessari per fiammatura ripetuto. Aprire il coperchio della piastra di agar, e distribuire il campione sul centro di agar. Chiudere il coperchio. Usare una tecnica asettica durante tutta la procedura. Aliquotare 100-150 microlitri di campione per piastra. Questoil volume faciliterà distribuzione uniforme delle cellule. Utilizzare un micropipettatore per trasferire il campione alla piastra. Controllare il flusso del campione in modo che non schizzare della piastra. Distribuire il campione agitando delicatamente le perline sulla superficie del agar 6 a 7 volte. Per garantire le cellule distribuiti in modo uniforme, con un movimento di scuotimento orizzontale. Non agitare le perline, oppure tutte le cellule finiranno sul bordo piatto. SUGGERIMENTO: Se fatto correttamente, la procedura suona come "shaking" maracas. Ruotare la piastra di 60 ° in orizzontale quindi agitare nuovamente da 6 a 7 volte. Ruotare la piastra a 60 ° una seconda volta e in senso orizzontale agitare nuovamente. A questo punto, si dovrebbe raggiungere anche la diffusione delle cellule attraverso la superficie agar. Al termine spread-placcatura, il campione deve essere assorbito e la superficie del agar deve essere asciutto. Eliminare i grani contaminati in un bicchiere di raccolta marcato contenente candeggina al 10%. Nongettare le perle nella spazzatura! Le perle che verranno utilizzati saranno sciacquato e sterilizzato in autoclave, ri-sterilizzarli per l'uso di ripetizione. NOTA: Se la superficie di agar è ancora umida, dopo agitazione per tre volte, permettono la piastra a sedere per alcuni minuti per permettere al liquido di essere assorbita dal agar, quindi ripetere i passi # 4-6 fino a quando la superficie della piastra sia secca. Capovolgere la piastra per l'incubazione. 5. Morbido Agar Overlay Procedura: formazione di placche per l'isolamento e la conta di Phage (Plaque Assay) Questa tecnica è comunemente utilizzato per rilevare e quantificare batteriofago (fago), virus o batteri che variano in dimensioni da 100 a 200 nm. Un microscopio elettronico è necessario per vedere le singole particelle fagiche. Tuttavia, la presenza di particelle fagiche infettive può essere rilevato come placche su una piastra di agar (Figura 7A). Fagi non può replicare fuori delle loro cellule ospiti batteriche, così la propagazione unorilevamento d richiede fagi di miscelazione e cellule ospiti insieme prima di placcatura. Per la procedura morbido agar molle, un volume piccolo, generalmente nell'intervallo da 50 microlitri di 200 pl, di una sospensione fago viene erogato in una provetta contenente circa 10 8 batteri (cellule ospiti) che sono uniformemente disperse in 2,5-3,0 ml di morbido (0,5 a 0,7% [w / v]), fuso agar nutriente. La miscela risultante viene versata sulla superficie di un disco (1,5 al 1,9% [w / v]) piastra di agar nutriente. La piastra viene agitata sufficientemente affinché l'agar molle copre l'intera superficie del agar duro. Quindi la piastra è posta su una superficie piana finché lo strato superiore agar ha avuto il tempo di solidificare e successivamente possono essere messi in incubatore. Nel tempo, una sospensione torbida di cellule batteriche, indicato come un prato, diventa visibile in tutto il mezzo di agar morbido (Figura 7B). Le placche formano se un fago infetta una delle cellule batteriche, replicati in thcella e, quindi lisa la cellula rilasciando fino a 100 fagi progenie (aka, la dimensione burst). Le particelle fagiche nuove diffondere nella agar morbido, infettare batteri nella zona circostante il lisato cellulare batterica. Dopo cicli multipli di infezione e lisi, la sospensione torbida cellula batterica in agar soffice scompare, lasciando una zona di radura chiamata placca. Ogni placca contiene più di 10 9 particelle fagiche, tutti geneticamente identici alla particella originaria fago infettivo. Poiché una placca nasce da una singola particella di fago, il risultante numero di unità formanti placche (pfu) possono essere contati e la concentrazione originale, o titolo, della sospensione fago può essere calcolato. Questo tipo di esperimento, chiamato un saggio di placca, scienziati fornisce anche un mezzo per generare uno standard passo curve di crescita, per indagare intervallo specificità dell'ospite, e per trasdurre cellule batteriche per esperimenti genetici. <strong> Preparare i batteri indicatori: una cultura in crescita esponenziale del ceppo ospite batterico deve essere preparato per l'esperimento morbido strato di agar. Ogni ospite ha le sue esigenze di crescita. Tra 0,3 ml e 0,5 ml di una sospensione di batteri che è richiesto per ciascuna piastra. Se una bottiglia di batteri indicatori viene preparato (ad esempio, 25 ml), la cultura deve essere suddivisa in piccole aliquote (ad esempio aliquote di 5 ml distribuiti in sterili tappo a vite tubi) per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione incrociata. I tubi possono essere tenuti in ghiaccio (a 4 ° C) fino al momento dell'uso nell'esperimento. Usare una tecnica asettica per inoculare brodo nutriente sterile ed incubare secondo le specifiche del ceppo batterico. Colture Leftover deve essere eliminata al termine della giornata. Preparare le provette di adsorbimento: posiziona due microprovette sterili in un rack. Etichettare il coperchio del primo tubo "Phage" e il coperchio del secondo tubo "controllo". Tipicodiluizioni seriali di ly lisati fagici vengono preparati e piastrate in questo caso provette da microcentrifuga supplementari essere aggiunti alla cremagliera e etichettato con il fattore di diluizione. Stock di fagi opportuno fresco da placche singole e conservati a 4 ° C. Per disaggregare particelle fagiche, le scorte dovrebbero essere riscaldata fino a temperatura ambiente prima di eseguire un esperimento. Fago scorte devono essere trattati con delicatezza – non vortex o pipettare vigorosamente. Aggiungere 50 microlitri del campione fago al primo tubo quindi si aggiungono 50 pl di tampone fago al secondo tubo, che servirà come controllo negativo per il saggio di placca. Usare una tecnica asettica in tutte le manipolazioni del fago e batteri. Avanti aggiungere 500 microlitri di batteri indicatori in ogni provetta di adsorbimento. Le cellule batteriche si depositano sul fondo di un tubo se seduto sul ghiaccio o banco per lunghi periodi di tempo. Se la cultura non è miscelareed prima di rimuovere una aliquota per l'esperimento, non abbastanza cellule batteriche sarà trasferito al tubo di adsorbimento. Ci deve essere un numero sufficiente di colonie batteriche formate in agar morbido (cioè, un prato) per la rilevazione di placche. Utilizzare un miscelatore a vortice delicatamente risospendere le batteri indicatori in una sospensione omogenea prima di trasferire aliquote per i tubi di adsorbimento. Mescolare le cellule batteriche e fago delicatamente sfogliando i tubi. Incubare la fago / miscela di batteri per 15-20 minuti (non più di 30 minuti) a una temperatura adatta per il ceppo indicatore. Preparare nutrienti agar agar molle e dure: Mentre è in corso di adsorbimento, posto due tubi soft agar (precedentemente sciolto e conservati a 55 ° C) su una piastra riscaldante al vostro banco di laboratorio fissata a 46-48 ° C. L'agar morbido fuso deve essere equilibrati alla temperatura del blocco riscaldante per 10-15 minuti. Se il morbido fusoagar si trova più di 15 minuti, comincerà a solidificarsi e formare grumi versate su l'agar duro. Se l'agar fuso morbida si trova a meno di 10 minuti, sarà troppo caldo quando aggiunto alla fago / miscela di batteri, uccidendo le cellule ospiti prima della placcatura. Di conseguenza, un prato e non possono formare placche pochi o non può essere rilevabile. Preparare ulteriori tubi soft agar se placcatura diluizioni seriali del lisato fagico. Etichetta attorno al bordo del fondo (non il coperchio) di due piastre di agar nutriente rigido piastre con almeno il nome, la data, il tipo di mezzo di crescita, e "Phage" o "controllo", corrispondente ai tubi di adsorbimento. Includere piastre aggiuntive etichettati con il fattore di diluizione, se placcatura diluizioni seriali. Le piastre di agar principali deve essere completamente asciutta senza condensazione sul coperchio e pre-riscaldata a temperatura ambiente prima di aggiungere il agar morbido. Se le piastre vengono conservati a 4 ° C, rimuoverli diverse ore o anche day prima. Stendere fuori in piccole pile scaglionati di non più di 2-3 piastre e lasciare asciugare. Umidità eccessiva nello strato agar rigido causerà diluizione del agar morbido, consentendo fago diffondere più facilmente attraverso l'agar molle durante la formazione della placca. Di conseguenza, la dimensione della placca aumenterà. Piastra di adsorbimento tubi uno alla volta come segue: utilizzare un micropipetta P1000 per trasferire asetticamente il fago / miscela di batteri (dovrebbe essere circa 550 pl) ad un tubo di agar molle poi rapidamente ruotare tra i palmi delle mani per mescolare il contenuto. NON agitare il tubo in modo che le bolle d'aria vengono introdotti. Tenendo il tubo con la mano sinistra, aprire il coperchio di una piastra di agar duro con la mano destra e subito a versare l'intero contenuto della provetta sulla superficie di una piastra di agar duro. Prima di chiudere il coperchio, oscillare delicatamente la piastra ma rapidamente per diffondere il fuso agar morbido su tutta la superficie della piastraprima che abbia il tempo di solidificarsi. Evitare di spruzzare l'agar fuso morbida sui lati della piastra di Petri. Chiudere il coperchio. Ripetere passo # 9 per tutti i tubi di adsorbimento, un tubo alla volta. Posizionare le piastre su una superficie piana e permettere loro di riposare fino a quando il soft agar è solidificato. Di solito 30 minuti è sufficiente. Capovolgere le piastre per l'incubazione. Piastre multiple possono essere impilate, quindi uniti poi invertito per l'incubazione. Dopo l'incubazione, le piastre possono essere ispezionati per placche. Il controllo negativo dovrebbe avere solo un prato di batteri (senza fori indicativi delle placche). Targhe variano in termini di aspetto dimensione, forma e in generale. Un tipo di fago dato può essere isolato da una miscela eterogenea di placche attentamente punzonatura al centro di una placca con uno stuzzicadenti sterile e trasferire l'inoculo ad un t microcentrifuga sterileUbe contenente 100-1000 microlitri di brodo o tampone del fago. Questo lisato può essere placcato con la stessa procedura descritta sopra. Almeno 3 a 6 successive singola placca isolamenti sono necessarie per garantire che un fago puro è stato ottenuto. Spesso il lisato deve essere diluito in un ampio intervallo (10 -1 a 10 -10) per trovare un titolo che produce non sovrapposti placche su una piastra. Il numero varia a seconda delle dimensioni della placca. 6. Replica Procedura Plate: trasferimento di cellule mutanti per screening e auxotrofi Questa tecnica consente di confrontare crescita cellulare su una piastra primaria a piastre secondari, generando un mezzo di celle di schermo per un fenotipo selezionabile. Prima un primario, o master, la piastra viene inoculato con cellule o con spread-placcatura una diluizione che produce colonie singole o trasferendoli ad una piastra in un modello spaziale indicate da segni della griglia. Piastre secondarie contenenti supporti con inibito la crescitarettamente i visitatori o supporti che manca di una determinata sostanza nutritiva vengono inoculate con cellule provenienti da colonie sulla piastra primaria. Il modello spaziale delle colonie è riprodotta prima premendo un pezzo di velluto alla piastra primaria. Le cellule batteriche aderiscono al velluto perché hanno una maggiore affinità per il velluto che per l'agar. L'impronta di celle sul velluto poi viene trasferita più piastre secondarie con crescita cellulare che riflette lo stesso schema colonia come quella della piastra primaria. In altre parole, è come avere un timbro di gomma, replicando il modello di crescita da una piastra all'altra. Questa tecnica è vantaggiosa perché consente un numero relativamente elevato di colonie da sottoporre a screening simultaneamente per molti fenotipi in un singolo esperimento. Preparare primario piastra: Label attorno al bordo del fondo (non il coperchio) di una piastra di agar con almeno il nome, la data e il tipo di mezzo di crescita. Contrassegnare off una griglia sul fondo della piastra conalmeno due linee verticali equidistanti e almeno due linee orizzontali equidistanti. Numero delle piazze che ne derivano. Utilizzare un pre-sterilizzato stuzzicadenti per inoculare ogni quadrato con un campione di cellule. Per ogni campione, tamponare il centro della piazza. Non coprire l'intera piazza con le cellule (Figura 8), oppure il campione invadere e contaminare quando incubati piazze circostanti. Ogni piazza sarà inoculato con un campione diverso, derivato sia da colture in brodo o colonie su un altro piatto. Capovolgere e incubare la piastra primaria, che verrà utilizzata per inoculare vari supporti secondari. Inoculare le piastre secondarie: Stack il piatto principale e tutti i piatti secondari. Con un marcatore, effettuare un marchio di orientamento sul lato delle piastre. Assicurarsi che il contrassegno è sul lato inferiore di ciascuna piastra non, il coperchio. Ottenere un panno di velluto sterile e posizionarlo sul blocco cilindrico (FIGURA 9). Bloccare il panno di velluto a posto con il titolare. Si noti il ​​marchio orientamento sul blocco. Il blocco dovrebbe essere la stessa dimensione del fondo di una capsula Petri (10,2 cm di diametro). Esso dovrebbe venire con un anello di bloccaggio che blocca il tessuto vellutino al blocco, mentre replica plating. Il tessuto vellutino (15,2 x 15,2 cm quadrati) deve essere pre-sterilizzati. Stack 10 o 12 piazze pulite poi avvolgerli in un foglio di alluminio, quindi inserirli in autoclave a 121 ° C il ciclo di asciugatura (impostazione di gravità) per 30 minuti. Prima di utilizzarli in un esperimento di replica plating, assicurarsi che siano completamente asciutte mettendoli in un forno caldo per diverse ore. Si noti che piazze velluto può essere necessario de-lintati con nastro adesivo prima della sterilizzazione. Piazze Velveteen possono essere riutilizzati. Dopo piazze velluto utilizzati sono stati decontaminati in autoclave, devono essere risciacquati in acqua pura e ri-sterilizzato come descritto sopra. Il blocco cilindricok e fascetta devono essere disinfettate impieghi, con un breve risciacquo nel 70% (v / v) di etanolo o di candeggina al 10%. Togliere il coperchio e capovolgere la piastra primaria. Allineare il segno di orientamento sul piatto con il marchio sul blocco. Abbassare la piastra in modo che la superficie di agar è in contatto con il telo vellutino sul blocco cilindrico. Leggermente ma uniformemente premere con la punta delle dita sul retro della piastra primaria e quindi con cautela sollevare la piastra primaria lontano dal blocco. Sostituire il coperchio sulla piastra. L'impressione di velluto di cellule dalla piastra primaria può essere utilizzato per inoculare circa 7-8 piatti secondari prima impressione con un velluto esigenze nuove da fare. Ripetere passo # 7 con ciascuna delle piastre secondari. Come controllo positivo, la piastra ultimo della serie dovrebbe essere un terreno di agar in cui tutti i ceppi testati deve crescere. In questo modo è possibile confermare che le cellule sono state trasferite a tutti secondaria plAtes della serie. Altrimenti, la mancanza di crescita su un mezzo di prova particolare può essere attribuita a trasferimento di celle insufficiente piuttosto che un fenotipo del ceppo. Per evitare falsi positivi, i piatti secondari devono essere ordinati dal meno al substrato più favorevole. Altrimenti, nutrienti possono essere trasferiti tra le piastre consentendo alle cellule di crescere su un mezzo sfavorevole. Capovolgere le piastre e incubare. Nota: Durante l'ispezione i piatti secondari per la crescita, assicuratevi di distinguere tra crescita e un'impronta. Quest'ultimo è un risultato negativo. 7. Ripulire lo spazio di lavoro Spegnere il bruciatore Bunsen poi mettere da parte tutte le forniture tra culture su lastre o tubi, supporti aggiuntivi e altri reagenti. Non permettere che le culture antiche, sia su piastre o tubi, per accumulare sul banco di laboratorio o in aree di stoccaggio. Questi campioni, che sono notoriamente fonti di contaminazionecome stampi e indesiderati specie batteriche, deve essere eliminato non appena non sono più necessari. Luogo contaminati da laboratorio (guanti, puntali, le Kimwipes), vetro (tubi, flaconi, bottiglie) e rifiuti pericolosi (colture batteriche o soluzioni fagi, piatti usati) nella presa corretto smaltimento. Quando si lavora con un non-patogeno E. coli ceppo (BSL-1), solo non-infettiva viene generato rifiuti pericolosi. Quando si eseguono le medesime procedure con organismi patogeni (BSL-2 o superiore), i rifiuti pericolosi infettiva viene generato. Indipendentemente dalla loro classificazione biohazard, rifiuti pericolosi devono essere autoclavati o disinfettati prima di essere scartato. Seguire le linee guida descritte nella BMBL (5 ° ed.) Così come quelle fornite dal proprio ambiente e la salute istituzionale dipartimento di sicurezza per lo smaltimento immediato e corretto rischi biologici generati durante un esperimento. Pulire l'area di lavoro con un disinfettante. Lavarsi le maniaccuratamente con sapone antisettico e acqua calda prima di lasciare il laboratorio. 8. Risultati rappresentativi Streak-piastra tecnica. Un esempio applicativo di placcatura striscia è mostrato in Figura 1. Questa procedura viene utilizzata per isolare le colonie batteriche da colture di cellule miste ed è di gran lunga una delle tecniche più importanti per master in microbiologia e genetica molecolare. Ogni colonia rappresenta una popolazione di cellule che sono geneticamente identici. Per molte applicazioni a valle è indispensabile per iniziare con una singola colonia o una coltura pura batterica generata inoculando supporti con cellule provenienti da una singola colonia. Ad esempio, la morfologia delle cellule individuali all'interno di una colonia può essere verificato utilizzando un microscopio ottico. Identità genetica può essere assegnato dal sequenziamento del gene piccolo RNA ribosomiale subunità da DNA genomico isolato da una coltura cellulare iniziato con una singola colonia.E caratteristiche metaboliche possono essere descritti sottoponendo cellule di vari saggi biochimici e fisiologici. Solo effettuando tali esperimenti con colture pure si può essere certi delle proprietà attribuite ad un particolare microrganismo. I risultati non sono oscurate dalla possibilità che la cultura è contaminato. Gli errori tecnici possono verificarsi se la sterilità dello strumento utilizzato per streak le cellule attraverso la piastra non viene mantenuta durante tutta la procedura. Dimenticare di fiamma, un ciclo o recuperare uno stuzzicadenti fresca tra i quadranti rendono difficile ottenere singole colonie. Alcune specie batteriche non può essere isolato in coltura pura in quanto dipendono da una società cooperativa con un'altra specie batteriche per i requisiti di taluni fattori di crescita. Definita syntrophs, questi microrganismi possono essere coltivate in condizioni di co-coltura, quindi colonie (se formato) sempre sarà costituito da due o più specie. Un'altra sfida incontrato in laboratorio quando si esegue lastreak-plate procedura con i batteri provenienti da campioni ambientali è che le cellule presentano caratteristiche di crescita che si discostano da ceppi di laboratorio tradizionali, quali E. coli. Tali ceppi batterici possono produrre colonie che sono filamentoso (rispetto a gruppi ravvicinati di cellule) con rami che si sviluppa su una grande sezione di una piastra di agar, calcificata e quindi refrattario alla penetrazione di una striscia-piastra strumento, o circondata da una capsula appiccicoso in modo che le singole colonie non si può discernere. Queste caratteristiche rendono difficile purificare singole colonie dalla striscia di piastra tecnica. Pour-piastra tecnica. Con il pour-piastra tecnica, le colonie formano all'interno del agar nonché sulla superficie del terreno agar fornendo così un mezzo conveniente per contare il numero di cellule vitali in un campione. Questa procedura viene utilizzata in una varietà di applicazioni industriali. Ad esempio, è fondamentale per acque reflue a trevore pianta, che è responsabile della pulizia dei rifiuti liquidi (ad esempio, di depurazione, che possono fuoriuscire dai tombini) generato da proprietà domestiche, commerciali e industriali, nonché le pratiche agricole, per analizzare campioni di acqua in seguito al processo di purificazione. Acque reflue trattate (acqua non potabile), viene riutilizzata in una varietà di modi – per l'irrigazione di colture non alimentari in agricoltura, per il lavaggio in residenze sanitarie e nelle torri di raffreddamento industriali – quindi deve essere esente da sostanze chimiche e la contaminazione microbica. Acqua potabile (acqua potabile) deve essere purificato secondo gli standard EPA e viene testato con metodi microbiologici fasciame che consentono l'enumerazione di specifici agenti patogeni umani. In figura 10 sono colonie batteriche risultanti da cellule di batteri presenti in un campione di acqua raccolto da una fontana pubblica. E 'improbabile patogeni queste colonie batteriche prodotte a seguito delle misure di depurazione per l'acqua potabile, tuttavia, i microbi sono tuttie dove la contaminazione da persino non patogeni può essere minimizzato solo, non eliminato del tutto. Come altro esempio, una società farmaceutica ha bisogno di valutare il grado di contaminazione microbica, o bioburden, di un nuovo farmaco in fase di produzione, stoccaggio e trasporto. Testando il farmaco durante diverse fasi del processo di placcatura e campioni utilizzando il pour-piastra procedura, la carica microbica, o numero di batteri contaminanti, può essere facilmente determinata. Le misure cautelari possono quindi essere concepita per ridurre al minimo o eliminare la contaminazione microbica. Uno degli errori più comuni tecniche che si verifica quando si esegue il pour-piastra tecnica è insufficiente miscelazione del campione con le colonie agar fuso provocando ad ammassarsi rendendo conteggio delle piastre imprecisa. Un altro errore frequente è versare l'agar fuso quando è troppo caldo, uccidendo molte delle cellule batteriche presenti nel campione. Questo errore anche influisce sulla precisione della conta su piastra dando i numeri che rappresentano sotto-esimoe il numero totale di unità formanti colonie nel campione. Spread-Piastra Tecnica. Lo spread-plate tecnica è analogo alla procedura di pour-placca nella sua utilità come mezzo per effettuare conta su piastra vitali. Tuttavia, poiché le colonie che formano mediante la diffusione-piastra tecnica sono distribuite uniformemente su tutta la superficie del terreno agarizzato, cellule di colonie singole possono essere isolati e utilizzati nelle successive manipolazioni sperimentali (ad esempio, come inoculo per una striscia o una piastra brodo di coltura). Tre applicazioni comuni in cui la diffusione piastra tecnica è una componente importante sono esperimenti di arricchimento, di selezione e di screening. In tutte e tre le applicazioni, il tipo di cellula desiderata può essere separato dalla miscela e poi sottoposta a qualsiasi numero di test biochimici, fisiologici, o genetica. Un esperimento di arricchimento comporta placcatura una coltura mista su un supporto o in incubazione in piastre econdizioni AMBIENTALI che favoriscono la crescita di questi microrganismi all'interno del campione che dimostrano le proprietà desiderate, caratteristiche metaboliche della crescita, o comportamenti. Questa strategia non inibisce la crescita di altri organismi, ma i risultati in un aumento del numero di microrganismi desiderata rispetto agli altri nella cultura. Così, le colonie che si formano su una piastra di arricchimento probabile presentano proprietà fenotipiche che riflettono il genotipo desiderato. Ad esempio, se il tuo obiettivo è quello di coltivare batteri azoto-fissatori da un campione ambientale contenente una miscela di più di 1000 specie diverse di batteri, quindi placcatura il campione su un azoto carente di medie andranno ad arricchire per quei batteri che possono produrre questo composto dal atmosfera utilizzando le capacità metaboliche fornite da una serie di geni necessari per la fissazione dell'azoto. Un esperimento selezione comporta placcatura una coltura mista su un supporto che permette solo le cellule che conmantenere un particolare gene o un insieme di geni per crescere. Questo tipo di esperimento è comune in laboratori di biologia molecolare durante la trasformazione ceppi batterici con plasmidi contenenti geni di resistenza agli antibiotici. Se il vostro obiettivo è quello di coltivare solo le cellule ricombinanti, o quelli che con successo ha preso il plasmide, quindi placcatura il campione su un supporto che è stato integrato con una concentrazione appropriata della antibiotico selezionerà per quelle celle che presentano resistenza a questo farmaco particolare. Un esperimento di screening comporta una coltura mista placcatura su un supporto che permette di tutte le cellule vitali a crescere, tuttavia, le cellule con il genotipo desiderato può essere distinta da altre celle in base alla loro fenotipo. Di nuovo, questo tipo di esperimento è comune in laboratori di biologia molecolare quando si eseguono analisi di mutagenesi o geni clonazione in plasmidi. Un esempio classico, come mostrato nella figura 11, fa uso del gene lacZ Encoding β-galattosidasi, questo enzima consente alle cellule di metabolizzare X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside), un analogo di substrato suo substrato naturale, lattosio. La scissione di X-Gal per β-galattosidasi risultato un prodotto insolubile blu. Quindi, se un terreno contiene X-gal, e un campione contenente cellule sia con un tipo selvatico (funzionale) o mutante (non funzionale) gene lacZ vengono piastrate su questo terreno, quindi dopo l'incubazione di tipo selvaggio cellule che ospitano un funzionale lacZ gene apparirà di colore blu-colonie pigmentate, mentre le cellule mutanti con una non funzionale del gene lacZ apparirà come depigmentate ("bianco") colonie. Un problema tecnico riscontrato più di frequente quando prima imparare a eseguire la diffusione piastra tecnica è diseguale diffusione delle cellule sulla superficie agar. Quando si utilizza un giradischi e bacchetta di vetro, il campione può essere assorbito troppo rapidamente in modo tale che le colonie costituiscono solo vicino al centro della piastra. Wgallina facendo il "Metodo Copacabana", le perle di vetro sono roteato piuttosto scosso tutta la superficie agar. Di conseguenza, molte colonie crescere lungo il bordo esterno della piastra. In entrambi i casi la distribuzione risultante delle colonie non approfittare della superficie disponibile in modo completo le cellule possono aggregarsi e crescere in colonie che si sovrappongono rendendo conta su piastra imprecisa o distinzione di tipi di cellule irrealizzabili. Tecnica soft Agar Overlay. Una procedura simile alla diffusione-piastra tecnica per contare le colonie batteriche possono essere utilizzati per coincidere il numero di fago. Considerando che tra 30 e 300 cellule batteriche sono distribuite sulla superficie di agar conteggio delle piastre (cfu / ml), tra 100 e 400 particelle fagiche infettive sono mescolate con 10 8 a 10 9 cellule ospiti per conteggi placca (pfu / ml) all'interno di un livello di agar molle diffuse su tutta la superficie dura agar nutriente. Salvo dimostrato il contrario, si presume generalmente tcappello di una singola cellula batterica si divide e si accumula un gran numero di cellule geneticamente identiche in un unico cluster chiamato una colonia. Come discusso precedentemente, questa ipotesi non è valida quando le cellule crescono a grappoli (ad esempio, coppie, tetradi, catene o raggruppamenti di imprese) o visualizzare le caratteristiche di crescita, come capsule che ostacolano la formazione di un'unica colonia. Un'ipotesi simile viene fatto per la formazione di placche, che in ogni placca rappresenta l'attività di un singolo fago. Questa affermazione è vera solo se si fago infetta un batterio. Cosa succede se particelle fagiche più infettare un singolo batterio? Questo problema si riferisce ad un parametro importante statistico che devono essere considerate quando si esegue esperimenti con fago – molteplicità di infezione (MOI) – descrive il rapporto tra particelle fagiche infettive al numero di cellule ospiti in un campione. Poiché alcuni adsorbire cellule più fago mentre altre cellule fago assorbire solo o no, una popolazione di cellule ospite dovrebbe essere infettate ad un basso MOI (≤ 1) tO minimizzare la probabilità che una cella sia affetto da più di una particella fagica. Utilizzando l'unità di formazione della placca (pfu) come definizione funzionale evita queste complicazioni durante l'esecuzione di conteggi placca per calcolare il titolo di uno stock fago. Come mostrato in Figura 12, morfologia di placca varia per diversi fago. Alcuni fago generare placchette (pannello A), mentre altri danno luogo a grandi placche (pannello B). Un certo numero di variabili influenzano le dimensioni della placca. Ci sono ragioni tecniche che contribuiscono a questa variabilità. Per esempio, i media complete e di spessore agar difficile sostenere lo sviluppo delle grandi placche perché le cellule ospitanti possono sostenere la crescita del fago per un periodo di tempo più lungo. Una placcatura ad alta densità di cellule ospiti (> 10 9 ufc per piastra) causerà una riduzione delle dimensioni della placca. Utilizzando concentrazioni più basse di agar soffice aumenterà la velocità di diffusione fago particella nel agar soffice e quindi aumentare la dimensione delle placche. Richiamo °a questo aumento della velocità di diffusione può verificarsi involontariamente se le piastre di agar duri non sono completamente asciutte in modo tale che l'umidità condensa o eccesso nel piatto diluisce l'agar soft in overlay. Questa svista tecnica produrrà risultati non coerenti rispetto alle dimensioni della placca per un fago particolare. Dimensione di placca inoltre è relativa a una serie di eventi cellulari ospiti compresa l'efficienza di adsorbimento, la durata del periodo di latenza (lasso di tempo dal fago adsorbimento lisi della cellula ospite), e la dimensione scoppio (il numero di progenie rilasciato dalla una singola infezione). Una miscela eterogenea di dimensioni di placca può osservare se particelle fagiche infettare le cellule ospiti in diverse fasi di crescita batterica. Per esempio, quelli che assorbono durante la prima fase esponenziale fare grandi placche con il fago progenie più di quelli che assorbono in fase esponenziale tardiva. Come regola generale, fago litico produrre placche evidenti, mentre placche fagiche lisogeni forma torbide. HoWever, alcuni fago litico produrre modelli interessanti come il "toro occhio" targa mostrato nella Figura 12B. Queste placche evidenti sono circondate da un alone torbido perché tali cellule a bordo della placca non sono completamente lisate o possono essere resistenti alla infezione fagi. A "occhio di bue" pattern osservato con fago temperato è una targa con un centro torbido circondato da un anello chiaro. Questa morfologia riflette la MOI e la fisiologia della cellula ospite rispetto alla lisi-lisogenia decisione. Quando le cellule vengono prima infettate con il fago, il MOI è basso e le celle a crescere rapidamente, perché i nutrienti sono abbondanti; insieme questo facilita la crescita litica. Mentre le cellule sempre più lisi, il MOI aumenta e si forma una placca chiare. Lysogens nel centro della placca, tuttavia, continuano a crescere perché sono immuni alla lisi dando luogo ad una targa trasparente con un centro di torbido. La tecnica di sovrapposizione può essere modificato per i test di placca con virus eucariotici. Inallo stesso modo placche batteriofago modulo su un prato di cellule batteriche in agar morbido, virus eucariotiche formare placche su un monostrato di cellule coperti da un gel. Un monostrato confluente è un foglio di cellule che crescono fianco a fianco sulla superficie di un piatto di coltura, si toccano, ma non cresce su uno sopra l'altro. Per effettuare questo tipo di saggio di placca, aliquote di virus vengono aggiunti a monostrati suscettibili di cellule eucariotiche. Poi il monostrato è coperto con un agarosio basato terreno nutriente – questo gel limita la diffusione del virus progenie rilasciate dalle cellule infettate a celle adiacenti in monostrato. Di conseguenza, una zona sferica, o placca, viene prodotto che contiene cellule danneggiate dal rilascio di virioni. Per facilitare la visualizzazione dei coloranti, le placche che le cellule viventi macchia può essere applicato per la coltura cellulare che fornisce contrasto tra cellule infette e non infette. Il soft-agar tecnica di sovrapposizione viene utilizzata per esperimenti diversi saggi placca. In primo luogo, è significant ricordare che l'agar nutriente rigido è una matrice di supporto che permette la crescita di batteri. In secondo luogo, il soft-agar usata per la sovrapposizione può avere una composizione differente da quello agar nutriente rigido. In questo modo, il soft-agar può servire come mezzo di ceppi batterici di saggio per varie caratteristiche di crescita o proprietà metabolici. Ad esempio, la tecnica di sovrapposizione viene utilizzata per batteri schermo per la capacità di degradare cellulosa (Teather e Wood 1982). Colonie singole sono coltivate su un terreno non selettivo agar rigido quindi soft-agar contenente 0,1% (w / v) si sviluppa carbossimetil cellulosa (CMC) sulla superficie del agar duro. Dopo l'incubazione, le piastre sono inondati di macchia che permette la visualizzazione di zone di compensazione attorno alle colonie in agar molle. La compensazione è causato da enzimi idrolitici secreti dai batteri rompendo la cellulosa nel mezzo. Più recentemente, la tecnica di sovrapposizione è stata utilizzata per rilevare i batteri che inibiscono la crescita di methanogeArchaea nic trovato nel rumine del bestiame (Gilbert et al. 2010). Batterici isolati da campioni ambientali sono coltivate su un terreno duro agar nutriente colonie vengono poi sovrapposte con soft-agar contenente una cultura di methanogens. Dopo l'incubazione, le piastre vengono ispezionati per le zone di inibizione della crescita intorno alle colonie. Questo metodo identifica ceppi batterici che producono inibitori del methanogens in agar morbido. Gli errori più comuni tecniche che si verificano con il soft-agar tecnica di sovrapposizione si stanno riversando il fuso soft-agar sia quando è troppo caldo o troppo freddo. Se è troppo caldo, le cellule batteriche mescolato nel mezzo verrà ucciso prima della placcatura. Se è troppo freddo, poi il soft-agar formeranno grumi versate su l'agar duro. In entrambi i casi, i risultati saranno ambigue o illeggibili al meglio. Replica-plate procedura. Trasferimento colture da un tipo di terreno nutrienteall'altro per testare requisiti di crescita diventa abbastanza laboriosa se vi sono più di solo pochi ceppi. Placcatura replica è un metodo che permetta screening simultaneo di un grande numero di microrganismi. Per esempio, dopo mutagenizing una cultura di cellule wild-type, si possono diffondersi della targa diluizioni della cultura per ottenere piatti con singole colonie. Le piastre primari contengono un medium che sostiene la crescita di tutte le celle comprese wild-type prototrofi, che sintetizzano tutti i composti necessari per la crescita e auxotrofi mutanti, che trasportano una mutazione genetica in una via biosintetica rendendoli in grado di sintetizzare composti particolari essenziali per la crescita. Con placcatura la miscela di cellule su un terreno completo, i nutrienti mancanti può essere assorbita dall'ambiente. Per distinguere tra prototrofi e auxotrofi, le colonie possono essere replicate su un terreno minimo. Solo prototrofi sarà in grado di crescere. Poiché la distribuzione spaziale della piastra primaria è conservata, Comparissulla della piastra secondaria con la piastra primaria permette l'identificazione di colonie mutanti. Per determinare quale composto i mutanti non sono più in grado di sintetizzare, le colonie possono essere replicate su terreno minimo supplementate con composti specifici (ad esempio, amminoacidi, fonti di carbonio, vitamine, ecc). In questo modo, centinaia di colonie possono essere proiettati contemporaneamente utilizzando la procedura di replica-piastra. Un errore tecnico che poteva verificarsi sta utilizzando piastre di agar che sono troppo bagnato, causando colonie di striscio insieme contaminare tutte le culture sulla piastra. Questo produce risultati che sono del tutto inaffidabile. Un altro errore tecnico è di applicare una pressione eccessiva durante il trasferimento di cellule del vellutino ai piatti secondari. Ancora, dopo incubando le piastre secondarie, le colonie risultanti possono sovrapporsi produrre fenotipi crescita attribuiti alla contaminazione anziché auxotrofia. Non tutte le wild-type specie microbiche sono prototrofi, quindi la replica-pProcedura di ritardo può essere usata per selezionare contemporaneamente diversi ceppi di tipo selvatico per esigenze di crescita caratteristici. Come mostrato in Figura 13, "tocchi" di cellule provenienti da quattro differenti ceppi batterici Pseudomonas sono state piastrate in duplicato su una griglia-marcato piastra contenente mezzi completi chiamato YAT (pannello A). I ceppi sono stati poi replicati su tre piastre secondari (pannelli B, C, e D) composto terreno minimo (MSA) integrato con una fonte di carbonio differenti (acetammide, lattosio, e glicina, rispettivamente). I risultati dimostrano che due dei quattro ceppi di Pseudomonas (P. aeruginosa e P. stutzeri) sono incapaci di crescere su queste tre fonti di carbonio. Come controllo, i ceppi sono stati replicati su una piastra con mezzo quarto YAT per confermare cellule sono state trasferite nel corso della procedura. Poiché tutti e quattro i ceppi si sviluppano sulla piastra controllo YAT, le carenze di crescita esposti alle precedenti tre piastre della serie sono affidabili. Le replica-placcatura risultati sono riportati nella Tabella 1. Un errore comunemente fatto interpreta un'impronta di crescita su un piatto secondario come un risultato positivo. Ad esempio, confrontare il fenotipo di P. aeruginosa a quella di P. stutzeri su MSA + acetammide (pannello B). Quest'ultima mostra un impronta di crescita, che è un risultato negativo, e può verificarsi se nutrienti dalla piastra precedente vengono trasferiti con le cellule madre. Nessuna crescita di nuove cellule si verifica perché i nutrienti mancanti non sono disponibili per cellule progenie. E 'facile confondere l'impronta con una crescita reale. In caso di dubbio, l'esperimento deve essere ripetuto utilizzando un metodo alternativo come la striscia-placcatura cellule dalla piastra primaria su supporti secondari. Figura 1. Esempio di singole colonie su una piastra. Le sfere rosa vicino al centro della piastra sono colonie di Serratia marcescente, un Gram negativo, a forma di asta Proteobacterium in famiglia delle Enterobacteriaceae. Grazie alla sua preferenza per gli ambienti umidi, questo microrganismo si trova comunemente in crescita negli angoli delle vasche, in vasche lavello, piastrelle in stucco, e tende da doccia. S. marcescens è facile da riconoscere in quanto produce un pigmento rosso chiamato prodigiosin. Le colonie su questa piastra sono stati generati utilizzando la striscia-piastra tecnica, con singole colonie che appaiono nel quarto quadrante dopo incubazione a 30 ° C per 24 ore. Le altre tre quadranti mostrano crescita confluente in cui le cellule depositato sulla superficie sviluppata in agar colonie sovrapposti. Strumenti Figura 2. Utilizzato per streak-plate tecnica. Dall'alto verso il basso, indicati sono stuzzicadenti (piatto, è rotondo), un anello di filo, un anello di plastica monouso e bastoni di legno. Stuzzicadenti sono tipicamente trasferitiun becher di vetro con l'estremità larga giù poi coperto con un foglio quando in autoclave per la sterilizzazione prima dell'uso. Bastoni di legno vengono trasferiti in provette di 18 mm di prova poi in autoclave per la sterilizzazione prima dell'uso. Figura 3. (A) Streak-piastra tecnica utilizzando il metodo quadrante. Un ciclo di pre-sterilizzati, bastone o stuzzicadenti viene utilizzato per diffondere il campione attraverso un quarto della superficie agar con un rapido, liscio, back-e-quarto moto dal cerchio al centro della piastra. Questa azione viene ripetuta per ciascuno dei quattro quadranti della piastra. Dopo l'incubazione, la crescita cellulare appare lungo il percorso dello strumento utilizzato per depositare le cellule sulla piastra. Separazione meccanica di cellule in un campione misto utilizzando questa tecnica dovrebbe comportare singole colonie nel quarto quadrante (vedi Figura 1 per un esempio). Colonie singole sono indicati come unità formanti colonia (cfu). (B) Quando un anello metallico viene utilizzato per striscia-placcatura, esso deve essere sterilizzato utilizzando la fiamma di un becco Bunsen prima del contatto con l'inoculo o il mezzo agar. Ricordiamo che la parte più calda della fiamma è la punta del cono blu. Tenendo il manico dello strumento, posizionare il filo nella fiamma circa 3-4 centimetri dal ciclo. Lasciare abbastanza a lungo per il filo di diventare incandescente. Spostare il filo in modo che la fiamma si avvicina il ciclo. Assicurarsi che l'anello metallico viene raffreddato prima di toccare l'inoculo. Figura 4. Pour-Piastra tecnica. (A) Un piccolo volume di campione (da 0,1 a 1,0 ml) viene erogato in modo asettico in un piatto vuoto, ma Petri sterile con 5,0 ml usando una pipetta sierologico. (B) agar fuso equilibrata ad una temperatura di circa 48 ° C viene poi versata in una capsula di Petri con il campione. Dopo la chiusura del coperchio, la piastra viene agitato delicatamente per miscelare il campione eagar fuso. L'agar viene lasciata solidificare per circa 30 minuti quindi piastre vengono invertiti per incubazione. Figura 5. Spread-Piastra tecnica con un giradischi e diffusore in vetro. Dopo che la piastra di agar è posto su una piattaforma girevole, un piccolo volume di campione (0,1 a 0,2 ml) viene erogata asetticamente sul centro del piatto utilizzando una micropipetta. Il divaricatore è sterilizzato immergendolo in un bicchiere di etanolo poi passando attraverso la fiamma del bruciatore Bunsen per accendere l'etanolo in eccesso. Prima di entrare in contatto con il campione, il distributore deve essere raffreddata in contatto al agar vicino al bordo della piastra. La freccia viene delicatamente spostato avanti e indietro attraverso il campione su tutta la piastra, mentre il giradischi si sta lentamente filatura. Questa azione permette di graduale, ma anche la diffusione del campione sulla superficie agar. Dopo aver chiuso il coperchio, la piastra deve essere impostata sulla u bancondisturbed per almeno 5 minuti per consentire al campione di assorbire completamente nella agar prima di agitare la piastra di incubazione. Figura 6. Spread-Piastra tecnica con perle di vetro (Metodo Copacabana). Perle di vetro che sono state pre-sterilizzati in autoclave vengono versati sulla superficie di una piastra di agar seduto sul banco. Un piccolo volume di campione (100 a 150 pl) viene erogata asetticamente sul centro della agar usando una micropipetta. Con il coperchio della piastra di chiusura, un movimento di scuotimento orizzontale viene utilizzato per spostare delicatamente le perline avanti e indietro attraverso la piastra 6 a 7 volte, diffondere il campione. Questa azione viene ripetuta dopo aver ruotato la piastra 60 °. Il movimento di agitazione si ripete una terza volta a seguito di un'altra rotazione di 60 °. Una volta che il campione è completamente assorbito nel mezzo di agar, le perle sono travasato in un becher contenente il 10% candeggina. Illastre poi sono invertiti per incubazione. Figura 7. Soft-agar tecnica overlay usato per isolare e enumerare fago basa sulla formazione di placche (chiamato anche un saggio di placca). (A) La presenza di fago può essere rilevata come zone di compensazione, o placche, confluente in una sospensione di colonie batteriche crescono in agar soffice. Fago T4 è una virulenta, a doppio filamento fago DNA che infetta il suo ospite, Escherichia coli, causando le cellule ospiti per lisare e rilasciare fago progenie. Dopo vari cicli di infezione e lisi, la vicina E. coli nella zona immediatamente circostante la cellula originaria host infetto svanisce lasciando una targa contenente miliardi di particelle fagiche T4. Fago T4 produce placche che sono circa 1 mm di diametro. In questo esperimento, 200 microlitri di una diluizione di 10 -5 uno x 2 10 8 pfu / ml stock di fagi T4è stato miscelato con circa 300 pl di E. cellule indicatrici coli preparato come in crescita esponenziale, coltura cellulare a 37 ° C. Sia il fago e batteri sono stati aggiunti ad un tubo di agar morbido EHA, misto, poi versata sulla superficie di una piastra di agar EHA dura. Si noti che non era necessario consentire fago e batteri per adsorbire prima placcatura in questo caso. Dopo aver lasciato l'agar molle a solidificare indisturbata per 20 minuti, le piastre sono state invertite e incubate a 37 ° C per 24 ore. (B) In assenza di infettare particelle fagiche, risultati crescita batterica in una sospensione torbida di cellule in agar morbido in cui colonie discrete non visibili. Invece, un prato anche di cellule batteriche, in questo caso E. coli forme durante l'intero strato agar morbido. Figura 8. Preparazione del piatto principale (master) con i campioni batterici. Per mantenere i campioni organizzati, il fondo della piastra può essere marcato in una griglia e piazze risultanti numerate. Ogni campione può essere assegnato un quadrato sulla griglia. Vengono mostrati alcuni esempi di modelli di inoculazione corretti rispetto al non corretto. Idealmente, un piccolo numero di cellule sono trasferiti al centro del quadrato utilizzando uno strumento sterile inoculazione come uno stuzzicadenti a "tamponare" del campione (cella # 4). Errori inoculazione comuni, come quelli illustrati nella cella # 5 ("patch") e cella # 6 ("fill"), determinare una crescita eccessiva di campioni batterici dopo l'incubazione, di conseguenza contaminanti piazze adiacenti. Figura 9. Replica piastra tecnica utilizzata per trasferire le cellule dal primario al secondario per gli schermi piatti fenotipo. Il marchio sulla piastra principale è allineato con il segno sul blocco coperto di velluto poi lowe rosso per consentire la superficie agar per contattare il tessuto. Le cellule vengono trasferiti dalla piastra al velluto, ma in modo uniforme con una leggera pressione verso il basso la piastra primaria con le punte delle dita. Questa azione lascerà un impronta dei campioni di cellule sul velluto nello stesso modello spaziale come il piatto principale. La stessa procedura viene utilizzata per trasferire le cellule dal vellutino ad una piastra secondaria. Ben 7-8 piastre secondarie possono essere inoculati con la stessa impressione piastra primaria sul vellutino. L'ultima piastra inoculata dal velluto dovrebbe servire come controllo positivo. Dovrebbe essere un supporto che supporta la crescita di tutti i ceppi testati, assicurando sufficiente trasferimento di cella è verificato tutta la serie di piastre. Dopo l'incubazione, le piastre secondarie possono essere consultati e ha ottenuto per la crescita rispetto a nessuna crescita. Così, più ceppi batterici possono essere proiettati contemporaneamente su diversi supporti di crescita in un singolo esperimento. _upload/3064/3064fig10.jpg "/> Figura 10. Risultato Esempio con pour-Piastra tecnica. Un campione 1,0 ml di acqua raccolta da una fontanella pubblica è stata distribuita in una piastra di Petri sterile vuoto. Poi sciolto ma raffreddato YAT è stato versato nel piatto con il campione. L'agar conteneva inoltre 100 pg / ml cicloeximide per prevenire la crescita di lieviti e muffe che possono essere state presenti nel campione d'acqua. Dopo rimestando delicatamente al mix, la piastra è stata impostata su una superficie piana e l'agar è stato permesso di solidificare completamente. La piastra è stata incubata a 37 ° C per 48 ore. La figura mostra il risultato di questo esperimento. Notare la differenza comparsa di colonie di superficie, che sono grandi e di forma circolare, rispetto ai sub-superficiali colonie, che sono molto piccole e irregolarmente forma perché il mezzo solidificato colonia inibisce la diffusione nel sub-superficiale. Figura 11. </strong> risultato Esempio con spread-plate tecnica. Il "Metodo Copacabana" è stato utilizzato per piastra una miscela di cellule di E. coli per un esperimento di screening. In questo caso, il mezzo di crescita (LB) contiene X-Gal, quindi le cellule che esprimono un funzionale β-galattosidasi colonie modulo blu enzimi mentre quelle cellule con una mutazione nel gene lacZ e quindi incapaci di esprimere un funzionale β-galattosidasi forma enzima colonie bianche. Spesso definito come un "blu / bianco schermo", i due tipi di colonie possono essere facilmente distinguibili l'uno dall'altro sulla stessa piastra. Figura 12. Risultato Esempio di saggio di placca con soft-agar tecnica di overlay. Vengono mostrati placche formate sul ceppo ospite Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) da due diversi pHetà: (A) Cacciatorpediniere Mycobacteriophage e (B) MSSS Mycobacteriophage. Questi fagi sono stati isolati dagli studenti del corso di laboratorio di UCLA MIMG 103 terdecies nella primavera del 2010. M. smegmatis è un non-patogeno Actinobacterium ed appartiene ad una famiglia di micobatteri che comprende pochi patogeni noti per causare malattie gravi come la tubercolosi (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) e la lebbra (M. leprae). Circa 50 pl di una diluizione di -2 10 Destroyers e 10 -3 diluizione di MSSS ciascuno sono stati incubati con 500 pl di M. smegmatis per 20 minuti a 37 ° C poi miscelato con MBTA (soft agar) e versato su MHA (agar rigido) piastre. Dopo aver lasciato l'agar molle a solidificare indisturbata per 20 minuti, le piastre sono state invertite e incubate a 37 ° C per 48 ore. Si notino le morfologie distinte placche prodotte da ciascuno dei fagi. Destroyers (A) forma piccolo (diametro medio di circa 1 mm), placche evidenti caratteristica di un fago liticomentre MSSS (B) sviluppa grande "occhio di bue" placche con i centri di chiare circondate da un alone torbido (diametro medio di circa 3,2 mm). L'anello nebuloso può essere costituito da batteri che sono resistenti alla infezione fagi. Questo modello è distinto da quello costituito dal fago lisogena, che producono placche torbidi. Figura 13. Risultato Esempio di utilizzo di replica-plate procedura. Quattro ceppi di Pseudomonas aeruginosa (P., P. putida, P. fluorescens e P. stutzeri) sono stati testati in duplicato per la crescita a tre diverse fonti di carbonio: acetamide, lattosio e glicina. (A) La piastra primario è un terreno completo (YAT) inoculato con le quattro ceppi come indicato. Dopo incubazione a 30 ° C per 24 ore, i quattro ceppi si sviluppano su YAT. Il piatto principale è stato utilizzato per piastra di replica su un minimo di medium (MSA) integrato con una fonte di carbonio unica: acetamide (B), lattosio (C), e glicina (D). La piastra ultimo della serie è stato un controllo positivo YAT piastra (E). Come mostrato, i ceppi mostrano modelli di crescita variabili dopo l'incubazione le piastre secondarie. Si noti che è talvolta difficile distinguere tra crescita e un'impronta di cellule. Ad esempio, confrontare l'impronta generato da P. stutzeri sui tre piastre MSA o nessuna crescita sul stessi tre piatti da P. aeruginosa. Entrambi sono risultati negativi rispetto ai modelli di crescita esposte da P. putida e P. fluorescens. Tuttavia, tutti i ceppi crescono sulle cellule positive piastra di controllo confermando sono stati trasferiti a tutte le piastre secondari della serie. I risultati di questo esperimento sono tabulati in Tabella 1. YAT (Primaria) MSA + acetammide MSA + lattosio MSA + glicina YAT (Controllo) P. aeruginosa + – – – + P. putida + + + + + P. fluorescens + + + + + P. stutzeri + – – – + Tabella riassuntiva 1. Dei risultati replica plating. La crescita indicato come segno più (+) e nessuna crescita rappresentato come segno meno (-). YAT è un mezzo completo (tryptone agar lievito) e MSA è un terreno minimo (minimo agar sali). Le piastre sono state integrate con MSA una fonte di carbonio unica come indicato.