القرار الزماني والمكاني من التلاعب الجيني الذي يحدد طائفة من الظواهر البيولوجية التي يمكن أن التشويش. هنا نستخدم زمنيا ومكانيا منفصلة<em> في الجسم الحي</em> electroporation ، جنبا إلى جنب مع خطوط المعدلة وراثيا من الزرد ، للحث على التعبير عن التحوير GFP تحديدا في الخلايا العصبية لحاسة الشم لمبة النامية.
في electroporation فيفو هو وسيلة قوية لإيصال البلازميدات التعبير الحمض النووي ، ورني الكواشف ، و[أليغنوكليوتيد] morpholino المضادة للمعنى لمناطق معينة من الأجنة النامية ، بما فيها تلك التي C. ايليجانس ، الفرخ ، القيطم ، الزرد ، والفأر 1. في الزرد ، electroporation في الجسم الحي وقد تبين أن القرار ممتازة المكاني والزماني لإيصال هذه الكواشف 2-7. القرار الزماني لهذا الأسلوب مهم لأنه يسمح لإدراج هذه الكواشف في مراحل معينة في عملية التنمية. وعلاوة على ذلك ، لأن التعبير من ناقلات electroporated يحدث في غضون 6 ساعات 7 ، وهذا الأسلوب هو أكثر ملاءمة من النهج المعدلة وراثيا. في حين أن القرار المكانية يمكن أن يكون دقيقا للغاية عندما استهدفت خلية واحدة 2 ، 6 ، غالبا ما يكون من الأفضل لدمج السكان في الكواشف خلية معينة داخل أنسجة أو بنية. عند استهداف خلايا متعددة ، في electroporation فيفو غير فعالة لتسليمها الى منطقة محددة من الجنين ، ومع ذلك ، لا سيما داخل الجهاز العصبي النامي ، فمن الصعب استهداف أنواع معينة من الخلايا فقط من خلال electroporation المنفصلة مكانيا. بدلا من ذلك ، محسن فخ خطوط المعدلة وراثيا تقدم ممتازة خلية نوع محدد من الجينات المحورة التعبير 8. نحن هنا وصف نهج يجمع بين المعدلة وراثيا فخ محسن Gal4 المستندة إلى خطوط منفصلة مع 8 مكانيا في electroporation فيفو 7 و 9 خصيصا لاستهداف الخلايا العصبية النامية بصلة الشم لدى الزرد. وآخرون (zic4 : Gal4TA4 ، UAS : mCherry) hzm5 (GA80_9 سابقا) محسن خط فخ الموصوفة سابقا 8 ، يعرض التعبير المعدلة وراثيا المستهدف للتوسط mCherry من الزرد الأمثل Gal4 (KalTA4) الترانسكربتي المنشط في مناطق متعددة من الدماغ النامية بما في ذلك الدماغ المؤخر ، المخيخ ، الدماغ الأمامي ، والبصلة الشمية. لاستهداف GFP التعبير على وجه التحديد إلى البصلة الشمية ، وهي البلازميد مع تسلسل ترميز GFP تحت سيطرة Gal4 مواقع متعددة ملزمة (UAS) وكان في نهاية electroporated الأمامي من الدماغ المقدم في ساعات ما بعد الإخصاب 24-28 (HPF). على الرغم من أن هذا الأسلوب يتضمن الحمض النووي البلازميد في مناطق متعددة من الدماغ الأمامي ، هي فقط التي يسببها GFP التعبير في التعبير عن الخلايا transgenically عامل النسخ KalTA4. وهكذا ، وذلك باستخدام خط GA080_9 المعدلة وراثيا ، أدى هذا النهج في التعبير GFP حصرا في البصلة الشمية في البلدان النامية. وأظهرت الخلايا المستهدفة عن طريق GFP معربا عن هذا النهج التوقعات محواري نموذجي ، كما هو موضح سابقا لخلايا المترالي من البصلة الشمية 10. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتسليم المستهدفة من الكواشف الأخرى بما في ذلك القصيرة القاسي البلازميدات التدخل RNA التعبير ، والتي من شأنها أن توفر طريقة لمكانيا وزمانيا منفصلة تحليل الخسارة من وظيفة.
وقد وصفت هنا لدينا خبير في أسلوب electroporation المجراة في الزرد التي تستخدم في فخ محسن Gal4 خط المعدلة وراثيا لاستهداف تعبير عن التحوير electroporated لمجموعة سكانية محددة من الخلايا الشمية في لمبة والنامية. هذا النهج يجمع بين ممتازة القرار الزماني في electroporation فيفو 7 مع التعبير الخلية نوع معين بوساطة خطوط محسن وراثيا فخ 8. على الرغم من هنا قد وصفنا في استهداف البصلة الشمية ، electroporation في الجسم الحي ويمكن استخدامها لاستهداف مناطق أخرى من الجهاز العصبي النامي 2-7 ، ومحسن خطوط فخ تتوفر مع التعبير تستهدف Gal4 في العديد من مختلف أنواع معينة من الخلايا أو الأنسجة 8 ، 11. بالطبع ، يجب أن تكون هذه التقنية electroporation أيضا مناسبة للمناهج أخرى combinatioral الوراثية مثل تيت به lexa أو أنظمة 13 ، 14 ، 15. والميزة الرئيسية لelectroporation هو أن ليس هناك حاجة لجعل خطوط المعدلة وراثيا إضافية نظرا إلى أن مناسبة Gal4 سطر هو متاح. هذا يحفظ ستة أشهر.
في الجسم الحي electroporation يسمح لدمج الخلايا العصبية في [أليغنوكليوتيد] وسلائفها في أي مرحلة معينة من تطور الجهاز العصبي هو من مصلحة 7. هذا القرار الزماني هو مفيد خاصة بالنسبة للخسارة من وظيفة التحليل لأنه لا يمكن الالتفاف على المشاكل مع استهداف الجينات التي لها وظائف أساسية في مراحل سابقة التنموية. ويمكن أيضا الأسلوب وصفنا هنا أن تستخدم لإدراج الخسارة من وظيفة بما في ذلك [أليغنوكليوتيد] [رني الكواشف أو يبني وmorpholino المضادة للشعور [أليغنوكليوتيد] 4 و 7. ويمكن أيضا البلازميد يحركها الكواشف مثل المهيمنة سلبية البلازميدات التعبير البروتين أو دبوس الشعر القصير البلازميدات رني أن توضع تحت سيطرة UAS Gal4 ، والسماح لنوع محدد خلية التعبير الدقيق لدينا هو موضح هنا للتعبير عن GFP.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة في منطقة R15 جون هورن (NIMH ؛ R15MH083221).
Reagents:
Equipment: