Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

1. Clearing Bloed van vasculatuur Verdoven muis door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine met 10 mg / kg xylazine verdund in 0,25 ml zoutoplossing. Als de verdoving eenmaal is bevestigd door geen reactie op een poot snuifje, gebruik schaar om een ​​incisie te maken over de borst met een schaar net onder de xyphoid proces, snijd diafragma, en de in stukken gesneden tussen de dorsale en ventrale segment van de ribbenkast naar borstholte bloot te leggen. Expose hart door het vouwen van het borstbeen en aangrenzende borstwand en veilig met hemostat. Open de pericardiale zak met een pincet om het hart bloot te leggen. Zet perfusie pomp (100 mm Hg druk) is aangesloten op PBS plus heparine (5 eenheden / ml) oplossing in warm waterbad bij 37 ° C en buis met een stompe 22 gauge naald op de uitstroom. Warme Steek de naald in de linker ventrikel, de buurt van de top van het hart. Onmiddellijk opengesneden het recht atrium tot systemische bloed uitstroom mogelijk te maken en blijven spoelen totdat de bloeddruk is uit de circulatie. 2. Perfusie van Casting Agent in het vasculaire systeem Bereid Microfil (Flow Tech, Inc Carver, MA) gietoplossing per protocol van de fabrikant: Mix 5 ml van de MV oplosmiddel met 4 ml gefilterd MV verbinding. Voeg 450μl (5%) van de katalysator (MV verharder). Oplossing werktijd is 20 minuten, maar mengen onmiddellijk voor gebruik om de juiste viscositeit te garanderen. Terug te trekken casting agent oplossing in een 10 ml spuit, voeg een stompe 20 gauge naald op de spuit en vul de naald met de oplossing. Steek de naald in de linker ventrikel door dezelfde opening gebruikt voor het spoelen van het bloed. Veilige naald op zijn plaats met hemostaat klem op het hart. Injecteer casting agent oplossing langzaam in de linker ventrikel op ongeveer 3 ml / min. Overdruk kan leiden tot onjuiste stroom van casting agent of potentiële schip breuk. Kijk naar tekenen van een succesvolle perfusie, zoals: visualisatie van castING agent in darm en lever vaatstelsel, distale ledematen verkleuring, en neus en tong verkleuring. Stel de naald indien nodig voor een goede doorbloeding te bereiken. 3. Verzamelen en verwerken van Tissue 'S nachts te verwijderen hersenen en in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C. Uitdrogen hersenen door het plaatsen van paraformaldehyde direct in toenemende mate geconcentreerd EtOH bij kamertemperatuur: 25% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 2 dagen en 100% EtOH, 2 dagen . Verduidelijken hersenweefsel rondom de bloedvaten door onderdompeling van de perfusie hersenen in methylsalicylaat gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur. Vaatstelsel van de hele unsectioned verduidelijkt hersenen kunnen worden afgebeeld met de hersenen ondergedompeld in methylsalicylaat onder een dissectie microscoop (afb. 1) (Leica MZFL III microscoop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) of helderveld microscoop (afb. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems). Reclarificationkan worden gedaan als weefsel is niet volledig gewist. Vanaf methylsalicylaat, transfer hersenen tot 95% EtOH voor 2 dagen, 100% EtOH voor 2 dagen, en methylsalicylaat voor 2 dagen. 4. Micro-CT Imaging of histologische Applicatie-Tissue Voorbereiding De hersenen kunnen worden afgebeeld met behulp van micro-CT direct na verduidelijking of na de re-hydratatie (afb. 4). Ter voorbereiding hersenweefsel voor histologische analyse, hydrateren de hersenen via seriële verdund EtOH: 100% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 2 dagen, 25% EtOH, 2 dagen , en op te slaan in PBS. De hersenen kunnen dan worden ingebed in paraffine behulp van een standaard procedure. 5. Representatieve resultaten Naar aanleiding van vasculaire gieten, kan de cerebrovasculature macroscopisch te zien is op de hersenen oppervlak (Fig.1A). De vasculaire boom in het parenchym kan gevisualiseerd volgende verduidelijking te worden (Fig. 1B). De gedetailleerde vasculaire structuurkunnen worden afgebeeld en geanalyseerd onder een helderveld microscoop (afb. 2), ontleden scope (afb. 3), en met micro-CT-scan (afb. 4). Met behulp van helderveld microscopie, kan het vaatstelsel worden bekeken op verschillende brandpunten vliegtuigen zonder snijden in de hersenen (Fig. 2A), alsmede individuele microvaten bij hogere vergroting (Fig. 2B). Onder een ontleding scope, kan men de gehele vasculaire structuur te zien in een focal plane, waardoor een betere visualisatie van de driedimensionale structuur van de cerebrovasculature (afb. 3). Foto's genomen in het kader een dissectie microscoop kan laten zien grote schip de morfologie en de hele hersenen vaatstelsel, maar missen de details getoond in foto's die met helderveld microscopie (Fig. 2B). Deze techniek heeft ons in staat om onregelmatige schepen op te sporen in onze experimentele BAVM volwassen muis model 2. Figuur 5 toont een voorbeeld van dezelfde onregelmatige schepen gedetecteerd door micro-CT scan (Fig. 5A) en helderveld microscoop (Fig. 5B). Samen vormen deze gegevens blijkt dat we kunnen analyseren thij hetzelfde monster met meerdere imaging-gereedschap na vasculaire gieten. Figuur 1. Whole hersenen van muizen na vasculaire gieten. Voor (A) en na (B) klaring door methylsalicylaat oplosmiddel. Schepen kunnen duidelijk gevisualiseerd worden op de hersenen oppervlak (A) en in parenchym volgende toelichting procedure (B). Figuur 2. Helderveld microscoop beelden van verduidelijkt vasculaire gegoten hersenen. Hersenen kunnen worden afgebeeld op verschillende vlakken en op verschillende niveaus vergroting. Schaal Bar 200μm (A) en 50μm (B). Figuur 3. Dissectiemicroscoop beeld in 1x met hele volwassen hersenen van muizen cerebrovasculature uit een dorsaal aanzicht. <img alt = "Figuur 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Figuur 4. Micro-CT-scan beeld van hetzelfde geheel volwassen hersenen van muizen getoond in figuur 3 uit een dorsaal aanzicht. Figuur 5. Toepassing van vasculaire casting methode om de hersenen een arterioveneuze misvorming op te sporen. A) Micro-CT scan van de hersenen toont vasculaire gegoten regio vergroot, onregelmatig AVM-achtige schepen in rechterhersenhelft van een ventrale te bekijken. Vergroot de afbeelding van de regio (witte doos) wordt weergegeven aan de rechterkant. B) Zelfde onregelmatige schepen zichtbaar onder helderveld microscoop met 50x vergroting. Schaalbalk 50 um.