Лентивирус-опосредованной генетических манипуляций и визуализация Обонятельные сенсорные нейроны В естественных условиях</em
Summary
Мы представляем лентивирусов методика генетических манипуляций и визуализации одной обонятельной сенсорных аксонов нейронов и его терминал разветвление<em> В естественных условиях</em>.
Abstract
Развитие точных обонятельных схема опирается на точные проекции обонятельной сенсорных нейронов (ОСН), аксоны их синаптических целей в обонятельной луковице (OB). Молекулярные механизмы OSN аксон роста и ориентации не до конца понятны. Манипулирование экспрессии генов и последующей визуализации одного аксонов OSN и их терминал беседка морфологии до сих пор подвергают сомнению. Для изучения функций генов на одном уровне ячейки в указанный период времени, мы разработали лентивирусов техника выполнения манипулировать экспрессии генов в OSNs в естественных условиях. Лентивирусов частицы поступают в OSNs путем микроинъекции в обонятельный эпителий (OE). Выражение кассеты затем постоянно интегрироваться в геном трансдуцированных OSNs. Зеленый флуоресцентный белок определяет выражение инфицированных OSNs и очертания всей своей морфологии, в том числе аксон терминал беседке. Из-за короткого времени оборота между микроинъекции и репортер обнаружения, исследования функции генов может быть сосредоточено в пределах очень узкого периода развития. С помощью этого метода, мы обнаружили GFP выражение в всего лишь три дня и в течение трех месяцев после инъекции. Мы достигли как по-выражения и shRNA опосредованной нокдауна от лентивирусов микроинъекции. Этот метод обеспечивает подробные морфология OSN клеточных тел и аксонов на одном уровне клетка в живом организме, и таким образом позволяет характеристику кандидата функции генов обонятельных во время развития.
Protocol
Discussion
Микроинъекции лентивирус приводит к постоянной передаче генные конструкции в геномной ДНК OSN. Такой подход позволяет нам выполнять краткосрочные или долгосрочные манипуляции генов-кандидатов через гиперэкспрессия или опосредованной shRNA нокдауна. Кроме того, мы можем флуоресцентно э…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование проводится при поддержке НИЗ DC052256 и DC006015 и NSF 0324769 на QG и T32-DC008072 к BS.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
Referenzen
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
