3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

1. 3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : acellular 계층의 준비 : 0.59 ML 10X EMEM, 50 μl 200mM L – 글루타민, 0.6 ML FBS, 120 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염 및 4.6 ML 소 콜라겐 I. 1 ML 추가 : 얼음에 50 ML 튜브에 다음과 같은 시약을 혼합 조직 문화 트레이의 각 삽입 혼합물. 실온에서 30 분 부화하고 젤 응고 수 있습니다. 혼합물의 색상은 밀짚 노란색에서 핑크색을해야합니다. DMEM가 중립 10 % FBS를 포함하는 추가, 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 flasks에서 인간의 섬유아 세포를 Trypsinize. 10% FBS와 1.5 ML DMEM에서 원심 분리하고 resuspend 0.45 X 10 6 세포의 세포를 수집합니다. 피부 줄기 세포 들어, 분야, 원심 분리를 분리 플라스크를 감청하여 6600 피부 분야를 (피부 줄기 세포가 줄기 세포 성장 매체 때, 그들은 neurospheres와 비슷한 방식으로 분야를 형성)를 수집합니다. 세포 계층의 준비 : 얼음에 50 ML 튜브에 다음을 믹스 : 1.65 ML 10X EMEM, 150 μl 200 MM의 L – 글루타민, 1.85 ML FBS, 350 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염, 14 ML 소 콜라겐 I 및 1.5 ML 섬유아 세포 현탁액 2 단계 (또는 피부 줄기 세포 reconstructs 는거 매체를 재구성 피부의 1.5 ML에서 0.45 X 10 6 섬유아 세포 및 피부 6,600 분야의 조합을 사용하여)에서, 잘 섞는다. 각 acellular 레이어 코팅 삽입하는 혼합물의 3 ML을 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 조직 문화의 인큐베이터에서 45 분 알을 품다. 혼합물의 색깔은 분홍색으로 노란색 밀짚에서해야합니다. 젤 굳은 후 DMEM 10 % FBS (2 ML 내부와 피부 재구성 트레이의 각 우물에 삽입 10 ML 외부)가 포함된 추가합니다. 4 일간 부화 및 겔 계약 있는지 확인하십시오. 각 삽입의 내부와 외부 모두에서 매체를 대기음. 정기적으로 혈청 씻어하기 위해서는 삽입의 외부 내부 10 ML에 (1 % dialyzed FBS와 HBSS) 2 ML을 매체를 세척 추가합니다. 37에서 1 시간 동안 품어 ° C. 피부의 준비 매체를 재구성 : 정상 melanocyte 및 피부 줄기 세포에 대한 reconstructs : 기본 매체 (500 ML)를 확인하려면 다음 시약을 혼합 : 490 ML keratinocyte 혈청 무료 매체, 1.8 ML 소 뇌하수체 추출물, 10 ML dialyzed 태아 소 혈청, 10 μg / 500 μl를 ML SCF, 4 μg / ML bFGF와 264 μg / ML 동부 표준시 – 3 500 μl의 562.5 μl. 중간 I : 100 μg / ML 100 ML 기본 매체 10 μl EGF를 추가합니다. 중간 II : 100 ML 기본 중간 2 μl EGF를 추가합니다. 중간 III : 300 ML 기본 매체 1 M의 720 μl CaCl 2를 추가합니다. 흑색증 피부를위한 재구성 : 중간 I (100mL)는 다음과 같은 시약을 혼합하려면 다음과 DMEM의 72.5 ML, F12 24 ML (햄의)을, 2 ML 200 mm의 L – 글루타민, 269g / ML 200 200 μl 하이드로코티손 500X의 μl ITES, 0.05 200 μl O – phosphorylethanolamine M, 90 MM 200 μl 아데닌, 2 NM 200 μl Progesterone, 1 240 μl CaCl 2 M 10 NM 200 μl Triiodothyronine 및 chelexed 신생아 송아지 혈청 100 μl (혈청 100 ML에 Chelex 100 3g을 용해 4 1.5 시간을 저어 ° C, 필터 소독). 중간 II (100mL)를 확인하려면, 다음과 같은 시약을 혼합 : DMEM의 72.5 ML, F12 24 ML (햄의)을, 2 ML 200 mm의 L – 글루타민, 269g / ML, 500X 200 μl ITES 200 μl 하이드로코티손, 0.05 200 μl O – phosphorylethanolamine M, 90 MM 200 μl 아데닌, 2 NM 200 μl Progesterone, 1 M의 240 μl CaCl2, 10 NM 100 μl 신생아 송아지 혈청 200 μl Triiodothyronine. 중간 III (300mL)를 확인하려면, 다음과 같은 시약을 혼합 : DMEM의 142.5 ML, F12의 142.5 ML (햄의), 200 mm의 L – 글루타민 6 ML을 269g / ML, 500X 600 μl ITES 600 μl 하이드로코티손 , 0.05 600 μl O – phosphorylethanolamine M, 90 MM 600 μl 아데닌, 2 NM 600 μl Progesterone, 1 720 μl CaCl 2 M 10 NM 6 ML 신생아 송아지 혈청 600 μl Triiodothyronine. , 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 flasks에서 인간 keratinocytes을 Trypsinize 간장 콩 트립신 억제제 (250 1X 인산염의 MG / L은 생리 버퍼)와 트립신을 중화, 스핀 다운 매체를 재구성 피부에 4.17에서 X10 6 셀 / ML을 세포 펠릿을 resuspend I. 피부에 X10 6 셀 / ML 중간 I.를 재구성, 스핀 다운 0.83에서 세포 펠렛을 resuspend, 콩 콩 트립신 억제제와 트립신을 중화, 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 인간 melanocytes 또는 문화 flasks에서 흑색증 세포를 Trypsinize 각 삽입의 내부와 외부 모두에서 매체를 세척 제거합니다. 피부가 중간 난 (각 삽입의 외부 내부 10 ML 1.5 ML)를 재구성 추가합니다. , keratinocytes과 melanocytes 또는 흑색증 세포 600 μl 세포 현탁액 600 μl 세포 현탁액을 잘 섞는다. 각 삽입 안쪽에 드롭하여 200 μl 혼합 세포 현탁액 드롭을 분배. 피부 줄기 세포가 재건 들어, keratinocyte 정지 100 μl를 사용합니다. 37 2 일 품어 ° C. 기음 피부 전을 중간 재구성내부 각 삽입의 외부 모두에서. 피부가 중간 II를 (외부에 내부 10 ML 2 ML) 재구성 추가합니다. 37 또 다른 2 일 품어 ° C. 기음 피부는 내부에서 매체 II를 재구성하고 각 삽입의 외부, 7.5 ML 피부는 외부 매체 III를 재구성 추가합니다. 이 시점부터의 표면은 공기에 노출되는 시작 reconstructs. 18 일까지 매일 중간 III를 변경합니다. 수확의 피부는 하루에 18 개조 : 내부와 삽입의 밖에서 미디어를 대기음. 포셉와 트레이에서 삽입을 제거합니다. 메스 블레이드로 가장자리에 원형 닫기 추적하여 (폴리 카보 네이트 필터 포함) 재구성을 잘라 버릴거야. 하드 표면에 절반으로 재구성 및 필터를 잘라요. 파라핀 섹션의 경우 : 2 블랙 TBS 생검 용지 사이 조직학 카세트의 재구성 이상 4 시간 동안 포르말린 10 % 전체 카세트를 적시게의 절반을 놓으십시오. 그런 다음 70 % 에탄올에 카세트를 배치하고 그것은 4 ° C 보관하면 파라핀의 포함에 대한 재구성을 처리하기 위해 준비가 될 때까지. 냉동 섹션의 경우 : 의 다른 절반을 플레이스 4 50 % 자당의 재구성 ° C를 1-2시간 들어, 다음 2M로 자당을 변경하고 다른 1-2시간 4 ° C에서 그것을 저장합니다. 그것이 보트의 약 50 %를 채우도록 일회용 기본 주형으로 최적의 절삭 온도 냉동 미디어 (OCT)를 분배. OCT에서 거품을 피하십시오. 포셉과 재구성의 가장자리를 잡고 자당의 재구성을 제거하십시오. Kimwipes은 자당을 흡수까지 Kimwipes에 놓으십시오. 포셉 및 주걱을 사용하여 OCT 위에 기본 주형으로 재구성을 전송합니다. 기본 금형이 완전히 가득 때까지 더 OCT과 재구성의 상단 커버. 당신은 어려운 절삭 것입니다 OCT에 거품이없는 있는지 확인하십시오. 조각 드라이 아이스에 골고루 기본 몰드를 삽입하고, OCT 완전히 동결 수 있습니다. 주석 박의 기본 금형을 싸서가 -70 ° C에 저장이 그라 이오 스탯으로 잘라 준비가 될 때까지. 이식 피부가 마우스 재구성 : DMEM 5 ML (동결 defrosting 마우스 피부)와 50 ML 팔콘 튜브를 준비합니다. 육주 주변 여성 SCID 사나이 답게 outbred 마우스를 사용합니다. 마우스 isoflurane (EZ 마취 시스템)와 함께 anesthetized입니다 초기 마취는 수술 중에 nosecone 숨통을 통해 4 isoflurane % (마우스가 수술 침대로 이동하기 전에) 및 유지 마취로 유도 챔버에서 수행됩니다 (isoflurane : 1.5-2 % ). 마취 중에 안구 부상을 방지하기 위해 저체온증과 적용 살균 안과 윤활제을 방지하기 위해 온수 패드로 열 지원합니다. 비커에 600 ML 물을 넣어 40 사이의 수온을 유지하기 위해 철판 위에두고 – 60 ° C. 복합 benzoin 팅크와 알코올 사립 면봉으로 마우스 피부를 청소하십시오. 나중에 suturing에 대해 동일한 순위를 유지하는 마우스를 다시 위에 라인을 표시합니다. 이리스 가위와 집게를 사용하여 마우스를 상단 뒷면에 직경 1.2 cm에 대한 원형 상처 침대 컷. 멸균 거즈 스폰지와 상처 침대 커버. 그것이 완전히 동결까지 DMEM 5 ML에있는 둥근 마우스 피부를 넣어 다음 액체 질소 용기에 둡니다. 서리를 없애다는 철판 위에 온수에있는 튜브가 완전히 해동까지. 3 회 반복합니다. 피부가 수술 블레이드를 사용하여 트랜 스웰에서 재구성 매우 신중하게 막을 제거 분리, 피부 상처 침대 위에 (최대 표피 사이드) 재구성 전송할 수 있습니다. 피부 재건 위에 마우스 피부 (최대 표피 사이드)를 놓으십시오. 이전에 표시된 마커의 첫 봉합, 마우스 피부를 해결하기 위해 양쪽에 두 번 더 봉합 후, 바닥에 두 번째를 확인합니다. 접목 후 클린 마우스 피부. nosecone를 제거하고 깨어 및 외래까지 온수 패드에서 마우스를 계속. 새 케이지에 마우스를 올려. 즉시 수술 후 피하 주사, 수술 후 24 시간 48시간에 의해 Meloxicam (1 MG / kg) : 수술 진통제를 게시합니다. 2. 대표 결과 : 피부는 정상 피부 melanocytes 및 줄기 세포로 reconstructs 피부는 삽입과 특수 6 잘 트레이에 양식 아르 reconstructs. 피부 구획은 첫 번째 사일 (그림 1A) 10 % FBS와 DMEM에 교양있다. 피부는 매체 keratinocytes가 melanocytes 또는 흑색증 세포 (그림의 1B)와 씨앗을 때 제가 사용을 재구성. 표피는 일 9시 공기에 노출이 keratinocytes는 (그림 1C) 차별화 수 있습니다. 18 일, 피부의 표피는 층상 keratinocyte 레이어로 구성되어 있습니다 reconstructs. undifferentiated 기초 레이어와 순차적으로 차별화된 레이어 (그림의 1D) 세로 방향으로하고 있습니다. 얼룩melanocytic 마커 S100과 reconstructs의 섹션을 주입하면 해당 melanocytes가 dendrite 확장 (그림 1E)를 통해 여러 keratinocytes로 표피와 의사 소통의 기초 레이어에 정렬됩니다 보여줍니다. 피부 칸막이는 콜라겐 유형 I 매트릭스에 포함된 섬유아 세포가 포함되어 있습니다. 입금 콜라겐 IV는 진피 (그림 1 층)에서 표피를 분리 지하 막을 나타냅니다. 피부 줄기 세포가 (GFP lentiviral 벡터로 표시) 콜라겐 I 매트릭스에 섬유아 세포와 함께 포함된 경우, 그들은 표피로 마이 그 레이션 및 melanocytes (1), (그림 2)로 구분. 표피에 keratinocytes 여러 레이어가 개발됩니다. 피부 흑색증 종양의 reconstructs Clinicopathological 연구에 따르면 stepwise 방식으로 melanomas 진행 : 공통 인수 nevi, dysplastic nevi, RGP (레이디얼 성장 단계) melanomas, VGP (수직 성장 단계) melanomas 및 전이성 melanomas (7). 흑색증 세포 라인의 다른 단계는 2 – D 문화 (그림 3A – D)에 서로 morphologically 비슷하지만, 그들은 피부가 reconstructs에 통합하는 경우, 세포의 동작들은 생체내 특성에를 반영합니다. 위치와 정상 melanocytes의 성장 속도는 밀접하게 피부 (그림 3E) reconstructs에서 제어됩니다. VGP melanomas WM793은 진피 (그림 3G)에 invasively 성장 반면 RGP 기본 melanomas WM35은 표피 (그림 3 층)에서 주로 세포 분열 따위에 의해 번식. 전이성 melanomas 1205Lu 적극적으로 진피 (그림 3H)에 깊이 침범. 그림 1. 피부는 정상적인 melanocytes로 reconstructs. 피부의 총 외관 AC로 표시됩니다 reconstructs. 콜라겐과 혼합된 A.의 섬유아 세포는 DMEM는 FBS 및 양식 피부 칸막이 10 %를 포함하는 재배하고 있습니다. B.의 Keratinocytes과 melanocytes는 진피 위에 씨앗과 매체를 재구성 피부 성장하고 있습니다. C. 표피는 일 9시 공기에 노출됩니다. D. H & E – 묻은 피부 재구성은 수직 구성 표피, 지향 기저 계층, 그리고 순차적으로 차별화된 층상 세포 레이어를 제공합니다. 진피는 콜라겐 유형 I 매트릭스에 포함된 섬유아 세포가 포함되어 있습니다. E. S100 – 긍정적인 melanocytes (검은색 화살표)가 여러 keratinocytes과 지하 막과 의사 소통에 정렬됩니다. F. 콜라겐 IV – 얼룩은 진피에서 표피를 분리 지하 막을 나타냅니다. DF의 모든 stainings는 포르말린 – 고정, 파라핀 – 임베디드 섹션에서 수행되었다. 그림 2. 피부에 피부 줄기 세포가 표피로 마이 그 레이션 및 melanocytes에 차별 reconstructs. 일 5시 시딩의 keratinocytes 후 단일 GFP 양성 세포 (녹색)이 분야에서 밖으로 마이 그 레이션 시작합니다. 표피는 여전히 하나의 레이어로 구성되어 있습니다. 일 8시, 몇 가지 세포가 표피 – 진피 인터페이스에 도달. 10 일, GFP 양성 세포는 단단히 지하 막 위치에 정렬됩니다. 이전 GFP 양성 표피 표현 melanocytic 표시 HMB45 (빨강, 흰색 화살표로로 표시)에 세포. 핵은 DAPI (파란색) 물들일 수 있습니다. 표피는 여러 계층으로 개발되고 있습니다. 지하 막이 흰색 점선과 함께 표시됩니다. 그림 3. 피부 melanomas의 다양한 단계의 reconstructs : AD. 일반 melanocytes 및 흑색증 전지는 2D 문화에서 성장. 포피에서 A.의 Melanocytes. B. RGP WM35 세포. C. VGP는 WM793 세포. D. 전이성의 흑색증의 1205Lu 세포. E. 일반 melanocytes은 지하 막에 위치하고 있습니다. F. RGP의 흑색증 WM35 세포는 표피의 세포 클러스터로 성장합니다. G. VGP의 흑색증 WM793 세포는 지하 세포막을 통해 진피에 침공. H. 전이성의 흑색증 1205Lu 세포가 적극적으로 진피 깊숙이 침범. 문제 해결 문제 문제 해결 콜라겐 혼합물이 응고되지 않습니다 콜라겐 혼합 색상이 분홍색으로 밀짚 노란색해야합니다 그렇지 않으면 산도 잘못하고 콜라겐 젤하지 않을 수 있습니다. 색상은 노란색 밝은 경우보다 나트륨 중탄산염가 드롭 들러 추가되어야합니다. 콜라겐이 성급하게 mixuture에 precipitates 콜라겐 혼합물이 삽입에 배치까지 얼음의 모든 구성 요소를 보관 계약 콜라겐은 (한쪽이 다른 쪽보다 두껍습니다)도되지 않습니다 인큐베이터의 선반을 보정 표피가 이하보다 세 keratinocyte 레이어로 형성됩니다. 낮은 구절에서 undifferentiated keratinocytes을 사용하여