原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

1。肺組織のストリップの準備肺組織は、高度に準拠しており、AFMの特性評価のための短冊状にカットすることは困難です。一時的に、切断の肺の構造を安定化させる2％低ゲル融点アガロース（PBSで調製）を50 mL / kg体重を気管内に隔離されたマウスの肺を膨らませるためには、37℃に温めた気管を結紮すると4℃のPBS槽に膨らんだ肺を冷やす° Cで60分間。アガロースはゲルと優しくこの間隔5の間に肺の構造を安定化する空域に固くするだろう。高いアガロース濃度、すなわち、百分の3〜4は、さらに切断の組織の安定化を高めるために使用されることがあります。 長さと幅5 × 5 mmおよび厚さ400μmのストリップにかみそりや手術用メスの刃でアガロース安定化マウスの肺組織を切断、その後、37に予め温めておいたPBS浴中にストリップを洗う° C 100 mlを使用して残留アガロースを除去するために5分間のベンチトップ加熱撹拌プレート上でガラスのビーカー。大規模な気道と血管を除外するには、主茎気管支から遠い胸膜下の領域からストリップをカット。気道と大型船がイメージングされる場合、主茎気管支へより近位の肺組織からストリップをカット。 2。 AFMのMicroindentationと蛍光イメージング AFMのmicroindentationのための関心の領域を分離するために、組織は、位相差顕微鏡により可視化した、または免疫染色および蛍光顕微鏡により可視化することができます。室温で固定または透過せずに免疫染色のため、2時間、目的の二次抗体（PBS中）のソースから5％の血清でブロックの組織ストリップ。 適切な一次抗体で組織のストリップをインキュベートする（例：ウサギ私は基底膜を可視化する間質コラーゲン（1:250希釈）、ウサギ抗ラミニン（1:250希釈）を可視化するために、抗コラーゲン）12ウェルプレートのウェルに1時間穏やかに振盪しながらロッカーに、1の蛍光タグ（例えばのAlexa Fluor ® 546ヤギ抗ウサギ二次抗体（1:250希釈））に結合した適切な二次抗体、続いて5分間PBSで各サンプルを3回洗浄室温で1時間。 4℃でPBSでPBSに保存して広範囲に組織片を洗う° C すぐにAFMの特性評価の前に、組織のストリップは、カバーの表面に均一に広がることを確認して、フローティング組織下からカバーを持ち上げて、ポリ- L -リジンコートした15mmのカバースリップに組織のストリップを取り付けます。必要に応じて、サンドイッチストリップ場合第二クリーン、コーティングされていないカバー付きとポリ- L -リジンコートしたカバースリップに組織のアタッチメントを支援するために穏やかな圧力を適用する。 microindentation実験の各ラウンドの直前に製造の命令を以下のAFMシステムを校正。 、実際のカンチレバーのたわみの距離にフォトダイオードの出力信号をスケーリングするために使用されるパラメータであり、2）カンチレバーの偏向感度、、Δdを1）カンチレバーの空気6の熱ゆらぎの方法を使用してバネ定数：2つの重要なパラメータを決定する。その後、力 – 変位曲線（図1b）の傾きを計算する清浄なガラススライド上にPBSで標準的な力 – 変位曲線を取得することにより、偏向感度を校正します。先端の変位、ΔZの関数として監視カンチレバーのたわみ、ΔD、と、力 – 変位曲線の測定では、AFMの先端が向かって拡張され、単一の場所で試料表面（XY方向にラスタなし）から退避。 我々は、5μmの直径ホウケイ酸球状の先端（Novascan）と窒化ケイ素の三角形カンチレバーを使用することをお勧めします。 0.06 N / mのばね定数と原子間力顕微鏡のプローブを使用して、我々は機械的に100〜50,000 Paをスパニングせん断弾性率と柔らかな素材を特徴付けている。 ティッシュペーパーとサンプルのカバーグラスの底部表面を拭く、真空グリースを標準ガラススライドに固定し、AFMの試料ステージ上にスライドガラスをマウントし、そして500μlのPBS（室温）を有する組織をカバーしています。 顕微鏡の試料ステージを調整することによって、視野の中心にAFMの先端を揃えるために表示するアイピース用の顕微鏡を設定します。 AFMの試料ステージを移動させることにより、組織上の関心領域を選択し、必要に応じて、位相コントラスト画像および/または組織の蛍光画像を記録するための表示CCDカメラに切り替えます。 それがサンプルと接触するまでゆっくりと下方向にAFMチップを移動することによって、標準的なAFMの婚約の操作を実行します。 柔らかい試料の正確なAFMのmicroindentationの特性評価は、小さな字下げの深さは弾性率の計算に使用ヘルツモデルを無効に大きな局所ひずみを避けるために必要です。大きなひずみを避けるために、500nmのカンチレバーの最大たわみ（トリガーポイント）を設定することにより、トリガモードでインデントを行います。このたわみの制限は抑制される最大押込み力に30未満NN（F =カンチレバーのバネ定数*の変位、またはF 最大 = 0.06 NN / nmの*は500nm = 30 NN）。 インデントの速度は、柔らかい試料7の弾性ではなく、粘弾性特性を探求するために十分に遅くなるように選択されるべきである。毎秒20から20程度の速度の範囲は、肺組織に適しています。 関心の領域から単一の測定では、興味のある場所にAFMプローブを移動し、標準的な力 – 変位曲線を（プローブがXYスキャンすることなくZ方向にのみ移動する）を収集するために、単一の字下げを行います。 関心領域の自動マッピングについては、フォースマップのモードに切り替え、選択した領域内にスキャンサイズとサンプルポイントを選択します。フォースマップモードでは、AFMチップの字下げの動きとの間の試料表面間のラスタ、および、定義されたサンプルの格子内の各ポイントで個々の力 – 変位曲線を収集します。より多くのサンプリングポイントは、より高い空間分解能を提供しますが、マッピングに必要な時間が長くなります。我々は、それが実用的〜10分で完了することができる1秒間に20μmのインデントの速度で80 ×80μmの領域をマップするために16 × 16サンプルのグリッドを使用することがわかった。 3。 AFMデータの抽出ヤング率を計算するには、非線形曲線を描くフィッティング8（図1、C）最小二乗法を使用してヘルツ球状インデントのモデルへの力-変位曲線を近似します。 ここで、F = K C *Δdが 、カンチレバーを曲げる力であり、k cは定数カンチレバーのバネであり、Rは球の先端の半径、δ=ΔZ – Δdは字下げで、υは、サンプルのポアソン比（ですυ=肺組織9の0.4）。 フィットの質を評価するために、非線形カーブフィッティング中に、SSRの値、またはデータと近似値の差の二乗和を計算する。大規模なSSRの値を持つ"悪い"の曲線からのデータを廃棄によって信頼性または非解釈測定値を排除する。 必要に応じて、弾性率（E）は関係がE = 2 ×（1 +υ）× G.、等高線マップのプロットの係数データを強制的にマップモードで収集された剛性の空間パターンを可視化するために使用して、せん断弾性率（G）に変換する（16 × 16サンプルのグリッドの例は、80 ×80μmの領域をカバーする）。 フォースカーブの大量のデータ、カスタムのアルゴリズムを処理するために自動的に力 – 変位曲線に合うように書き込まれる可能性がある、3.2と3.3（例：Matlabの）で概説と同じ手順とパラメータを使用して弾性率、および/またはプロットelastographsを抽出する。 図1（a）球状プローブを（Dimitriadis E.、ら、2002 Biophys J 8から許可を得て複製）を使用してリジッド基板上に柔らかい試料のAFM microindentationの回路図。 （B）代表の力 – 変位曲線は、カンチレバーの偏向感度を決定するためにPBSで清浄なガラススライドから収集。 （C）代表の力 – 変位曲線は、（）から対応するパラメータを示す（青）、ソフトと硬い（赤）のサンプルから収集。 4。代表的な結果： 図2Aは、直接関心領域上記の代わりにAFMプローブを含むPBSでポリ- L -リジンコートしたカバースリップに接続されているとmicroindentationマッピングの準備ができて肺実質のストリップを示しています。図2Bは、適切にカットし、染色された組織で、肺実質の肺胞のマイクロアーキテクチャは、同様に固定または透過せずに基底膜成分のラミニンのための免疫蛍光染色によって観察、保存されていることを示しています。コラーゲン線維症10を誘導するために以前にPBS（図2C）で処理したマウスから採取、またはブレオマイシン（図2D）で治療された新鮮な未修正の肺で、私は図2のCDショー免疫蛍光染色。 図3Aは、AFMのmicroindentationから得られた試​​料の力 – 変位のプロットを示しています。同じ応用力と、探針は小さいインデントと硬めの地域のための"急"の力 – 変位曲線に対して相対的に"平坦な"力 – 変位曲線で、その結果、ソフトな地域（青線）に大きなインデントを生成します（赤の線）。クリーンなフォースカーブを得るために、各インデントの後に探針は、次のインデントの前に試料表面との接触の無料から完全に退避する必要があります。この非接触状態では、先端がカンチレバーのたわみなしで変換する図3A、の曲線の平坦な領域に対応しています。図3Bは、先端が完全に試料表面から退避されていない場合（例えばソフトのサンプルが発生した平坦な領域がない典型的な偽の曲線を示しています。それが不可能な接触点を決定すること）の先端にttaches。先端が完全にソフトなサン​​プルの中に閉じ込めている場合は、図3Cに示すように、曲線は、明確なたわみが小さく、ノイズなし、見える​​場合があります。 図4は、剛性のマップ（elastographs）、せん断弾性率を有するカラースケールとして空間的に表示された力 – 変位曲線から抽出されたせん断弾性係数のデータを示しています。 Elastographsは特に線維化肺のサンプル内で印象的な正常の範囲と組織の剪断弾性率の分布の違い（図4A）と線維化（図4B）肺実質、およびせん断弾性係数の大きな空間的変動を、示す。 図2マウスの肺実質のストリップ上のAFMプローブを示す（A）位相差顕微鏡写真。スケールバーは50μm。 （B）正常マウスの肺組織におけるラミニンの免疫染色は、正常な肺実質の肺胞マイクロアーキテクチャを示している。白いボックスは、典型的な80で-80μmの弾性マッピング領域を示します。スケールバー：20μmである。生理食塩水（C）およびブレオマイシン（D）処理したマウスの肺実質におけるI型コラーゲンの（CおよびD）免疫染色。スケールバーは、100μmである。 図3（A）代表解釈力-変位曲線はそれぞれ、生理食塩水（青）とブレオマイシン処理した（赤）マウス肺実質から収集した。黒い線は、球状のヘルツのモデルに起因する最適であり、それらに対応する計算されたヤング率で標識されています。 （B、C）代表非解釈力 – 変位曲線。 図4。生理食塩水（A）およびブレオマイシン処理した（B）マウス肺実質から採取した代表elastographs。カラーバーは、キロパスカルのせん断弾性係数を示している。軸ラベルは、マイクロメートルの空間スケールを示している。スケールバー：20μm以下