Моделирование нейронных иммунной сигнализации эпизодической и хронической мигрени Использование распространяющейся депрессии In Vitro</em

Несколько точки Стоит подчеркнуть, для успешного изучения иммунной связанных сигнализации SD в мозге ломтиками. Во-первых, инициирование стимулы должны синхронно деполяризовать достаточный объем серого мозгового вещества инициировать SD. Это означает, настройки интерфейса (например, жидкости экспозиции только ниже и газообмен выше срез вставить культуры) не требуется. 1,2 Во-вторых, острый ломтики мозга поддерживать SD, но травмы от их подготовки, а также использовать 95%-кислородной газированные раствор Рингера генерировать провоспалительных изменений и эпилептиформной поведение соответственно, которые могут изменить нейронные функции цепи и иммунного гомеостаза. 3 В-третьих, в то время как гиппокампа культур ломтик преодолеть эти острые ограничения ломтик, важно отметить, что часть культуры должны быть сохранены для адекватной периоды до использования (т. е. больше чем за 10 дней в пробирке), так что микроглии и астроциты стать покоя. 3-5 Наконец, SD должна быть вызван использованием стерильных и асептических методов. Методы, описанные ниже, предназначены для удовлетворения этой потребности. 1. Распространение депрессии фрагмент культур Подготовка культуры и обслуживания. Фрагмент культуры готовятся и поддерживаются в верховой сыворотке основе средних или свободной от сыворотки среде (SFM) 6,7, как описано выше 8 с незначительными изменениями, среда. Инкубационный параметры 36 ° C, 5% СО 2, 95% влажности баланса воздуха. Мы считаем, что культуры могут быть переключены на SFM после 18 дней в пробирке и поддерживается, по крайней мере 35 дней в пробирке с использованием нашего ранее определенных SFM, которая включает дополнительный кальций и магний. Кроме того, антибиотики и antifungicide добавляются для предотвращения инфекционных загрязнения связан с несколькими эпизодами записи. Этот долгосрочный (или записи) среда разработки содержит (на 100 мл): Neurobosal среду, 97 мл; Джем-21, 2,0 мл; Glutamax (200 мм), 0,5 мл, гентамицин (10 мг / мл), 10 мкл; D-глюкозы (45%), 680 мкл, аскорбиновая кислота (0,5 М), 100 мкл; Fungizone, (250 мг / мл), 400 мкл; NaCl (5,0 М), 820 мкл, Mg 2 Cl 2 (1,0 М) , 80 мкл; CaCl 2 (1,0 М), 160-240 мкл. Культур используются для SD от 21-35 дней в лабораторных условиях. Живучесть проверки. 3,6,7 Культуры, проверяются на наличие пирамидальных нейронов смерти перед использованием. На 18 дней в пробирке, вставляет инкубируют в течение 20 мин в среде (при нормальных условиях инкубации), содержащий 5 мкМ Sytox зеленый, маркер, который становится люминесцентные, когда она связывается с ДНК (т. е. путем проникновения в мертвых клеток). Вставки затем переносятся обратно на свои прежние средние и разберитесь с флуоресцентной микроскопии (504 и 523 возбуждения излучения) для доказательства СА3 или СА1 пирамидальной травмы слой нейронов. Ломтики с более чем 20 клеток или стандартизированных уровень флуоресценции более 250 МЕ, были исключены из дальнейшего использования. Материалы изготовления. Земля электроды изготовлены с стеклянные трубки (2,0 мм OD / 1,16 мм ID) сократить до 4,5 мм длины и кратко огонь полированного с обоих концов. Мы производим около 20 электродов в то время, которое может длиться более года. Доведите 100 мл 1M KCl до кипения и добавляют при перемешивании 3,5 г агара и 0,5 г ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрата) для производства прозрачного желтого раствора. Используйте короткую длину гибкого шланга помещения в каждой стеклянной трубки сделать теплый KCl / агар раствор в стеклянных трубках, а также небольшое расстояние в гибкий шланг. Всасывания выбросов и позволяют KCl / агар капать медленно из открытых кончик стеклянной трубки, а затем держать открытым концом стеклянной трубки с кусочком льда. Последний маневр предложит агар в гель на кончик электрода, а не гель после отступает обратно в стеклянную трубку. Как только агар имеет загущенное в холодной проточной воде, гибкая трубка может быть удалена без изменения агар расположены в стеклянных трубках. Место 0,5 мл 1 М KCl в каждую лунку по 1,5 мл стойку трубки центрифуги. Затем поместите один кончик каждого KCl / агар заполнены стеклянной трубки в отдельных скважинах. Затем, удерживая 80 см длиной 15 серебряной проволоки датчика с кровоостанавливающего и чистой каждой из четырех сторон путем соскабливания провод через борт Эмери, удерживаемые до столешницей. Отрежьте провод на 4 см длины и поместить их в сцинтилляционный флакон заполнен отбеливателя в течение 20-30 минут на место фирма Ag-AgCl пальто на очистку поверхности серебра. Бенд каждый провод пополам и вставить свободных концов в один конец стеклянной трубки, заполненной шго KCl / агар, оставив около 4-6 мм подвергаются. Наконец, пальто хвостовиком стеклянную трубку с серебряной проволоки и небольшие размеры проволоки с Goop, водостойким клеем и гибкой, чтобы предотвратить KCl / агар от высыхания. Повторите эти действия для всех электродов. Пусть клей высыхания на ночь. Магазин электродов при 4 ° С в сцинтилляционных флаконов (5-6 электродов / флакон), содержащего ~ 5 мл 1 М KCl и 25 мг ЭДТА, что существенно замедляет рост бактерий. Запись электроды изготовлены из 1,5 мм (0,86 мм ID; 10 см длиной) боросиликатного стеклянные трубки с нитями (Видео рис. 1). Вытяните микроэлектродов в виде штрафа в наконечник с коротким стеклянные трубки тянутся к острым. Как правило, мы тянуть электродов ~ 7,5 см в длину с 1 см конус. Это позволяет адекватно позиционирования и визуализации электрода. Электроды берутся с Narishige ПЕ-2 съемника. Микроэлектродные советы сломанной спиной до 2-4 мкм при визуализации с помощью сложного микроскопа оснащен калиброванного оптического микрометра. Мы используем края стандартных слайдов гистологии стекла (25 х 75 х 1 мм), прикрепленными к гидравлическим одномерных микроманипулятора состоялась еще на 3-мерные манипулятор аккуратно разорвать микроэлектрода советы. Во-первых, электрод устанавливается придается стекло микроскопа использованием глины. Затем слайд помещается на держатель стекло микроскопа, который используется для перемещения кончика микроэлектрода близко к краю стекла скользнул прилагается к гидравлическим манипулятором. Наконец, кончик микроэлектрода мягко сломанной нажав на него против гидравлическим приводом край слайда микроскопом. Стимулирующие электроды скручены проволочными электродами биполярного, потому что: Они позволяют запись вызванных потенциалов поля, которые в противном случае была бы скрыта стимул артефакт из монополярной стимуляции. Биполярный стимулирующий электрод может быть применен к мягко зубчатой ​​извилине поверхность без повреждений, в отличие от заостренными электродами биполярного. Наконец, применяется ток локализованы в поперечном (голый) круговой поверхности тефлоновой изолированные провода для электродов. Стимулирование производства электродов начинается с резки ~ 20 см длиной платины и иридия (125 мкм голыми диаметром 200 мкм покрытием диаметре) и с тефлоновым покрытием проволоки. Затем согнуть длину пополам и связать концы с концами в свободный квадратный узел, оставляя 2 см от узла к концам проволоки. Закрепите узел в патрон электродрели положив руку на стол. Удерживая другом конце провода с кровоостанавливающего, кратко свою очередь, дрель и выключать, пока проволока плотно скрученный (то есть, каждый поверхности среза будет равном расстоянии друг от друга, когда проволока разрезается в поперечном направлении без распутывания ). Далее, голые концы платины и иридия витой должны быть присоединены к проводам используется для подключения стимулирующего электрода стимул изолятор. Это делается путем пайки свободные концы платины и иридия провод к ~ 50 см провода 30 калибра. Во-первых, лента платины и иридия витой провод к верхней скамейке и падение луже концентрированной соляной кислоты более свободный конец витой проволоки. Далее, сдирать около 1 см изоляции с каждого провода с помощью провода, катер. Место раздели на конец провода, прилегающей к концу витой проволоки и применять тепло от острым концом паяльника, то припой, пока два провода твердо прилагается. Промах малой длине термоусадочной трубки над оголенный провод связи и уменьшить его пригодным с теплом. Повторите эти действия для второй провод. Пожар польский кончик 15 см пипетки Пастера и руководство витой платины и иридия провод вниз пипетки до около 6 см выступает из витой. Используйте водоотталкивающие эпоксидных (например, JB Weld) опечатывать обоих концах электрода. Наконец, присоедините банан, чтобы привести концы провода для подключения к стимула изолятор. Под стереоскопического наблюдения, место электрода в ФБР и искать электролитически производится пузыри, идущие от только обрезанный конец электрода советы. Если какой-либо пузырьков происходят из сторон витой, вырезать электрод с поперечной обработке с использованием свежих одним лезвием бритвы края восстановить нетронутыми изоляции провода длинных осей. При устранении решить аберрантных эффекты стимулов, попробуйте сделать свежесрезанных электрода. Запись состоит из блюд, каквшей культуры вставить в 35 мм культуры блюдо, которое сидит на двух 1,0 х 12 мм стеклянных стержней расположенных около 1,0 см друг от друга. Прикрепить стеклянных стержней, чтобы блюдо базы путем нагревания стеклянных трубок, а затем нажать их в базу щипцами. Для статических условий записи, добавить 1,5 мл среды на блюдо. Затем смочите ~ 10 мм в ширину и 3-4 см в длину кусок стерильным ватным тампоном в 1,0 мл среды. Сложите хлопок пополам вдоль длинной оси и разместить его вдоль внутренней яме на вкладыше стерильным пинцетом. Мокрого хлопка помогает поддерживать блюдо влажности. Три сжимаемой 4 мм, длина трубы находятся на равном расстоянии вокруг вставки. Обложка блюдо сильно с поливинилхлоридной пленки, которая позволяет газообмена. Вырезать вокруг своей середине вертикальной стене с одним лезвием бритвы края, чтобы удалить лишнюю фильм поливинилхлорида. Электрофизиологические установки Вставить срез культуры сборка помещается в камеру ПОМИ записи электрофизиологических записей. Вставки / культура блюдо сборки в ПОМИ камеры покрыта толщиной 2 мм Диск снабжен пластиковой ПОМИ камеры, с различными маленькими отверстиями позиционируется как необходимые для записи электроды, средний приток / отток труб и т.д. Мы периодически контролировать рН среды с миниатюрными электродами рН и температуры комбинации с миниатюрной типа T термопарой смонтирован в запечатанном полу-микроэлектрода для обеспечения 7,3 рН и 36,0 ° С условиями. Вставки / камера газированные с 5% углекислого газа, баланс воздуха и средство принадлежит либо проведена статическая или в потоке (1,2 мл / мин) конфигурации с вставить центра состоится в 35-36 ° C. Для условий потока, средний подогревается со встроенным нагревателем, опять же, чтобы держать центр записи камере при 36 ° C. Перистальтического насоса с системой сброса давления приводит к среде на срез культуры без пульсаций от насоса. Аспиратор поставляется с камерой ПОМИ используется для удаления среды из вставки через нежное всасывание. Для устойчивости, камеры установлены на специально разработанных Берли-Гибралтар перевернутый столик микроскопа, который содержит инвертированный микроскоп и сидит на вибрации стола. Малые отверстия открываются через вставку поливинилхлорида обертывание с небольшим, с батарейным питанием прижигания инструмент. Далее, если поток конфигурации, которые будут использоваться, входной и выходной поток начинается с последующим размещением боковом электроде. В противном случае, проще говоря боковой электрод на место. Электроды, удерживается на месте с микроманипуляторами, расположены чуть выше срез визуализированы с помощью инвертированного микроскопа на 5-кратным увеличением (рис. 1). Начните с записи электрода следуют стимулирующих электродов. Мы используем аудио монитора отметить, когда микроэлектрода вступает в контакт с срез. Конец находится в середине вдоль СА3 пирамидальный слой клеток организма. Записи начались, а затем стимулирующих электродов мягко коснулся до середины поверхности зубчатой ​​извилины. В обоих случаях первоначальный движения электрода осуществляются с грубыми контроль, и окончательное позиционирование только с гидравлическими, штраф элементов управления с помощью фазового контраста освещения так, чтобы слои тела клетки можно легко отличить. Advance электродов в ~ 25 мкм шагом по прямым микроскопическим визуализации. Как только электроды касаются ткани, заранее электродов еще 20-30 мкм. Записи начаты до стимулирующий электрод ставится на место, чтобы быть уверенным, это не вызывает SD (то есть, через механический раздражитель). ~ 10 минут разрешено пройти, прежде чем эксперименты начались. Транссинаптически индуцированных SD. Оптимизация вызвала СА3 потенциалов поля следующим образом (рис. 2). СА3 потенциала поля вызываются с 100 мкс импульсов (0,2 Гц), начиная с текущего, что является достаточным, чтобы вызвать реакцию (например, ~ 1-5 мкА). Перемещение электрода записи с шагом вдоль пирамидальных нейронов длинной оси, пока потенциал поля максимальна. Затем, увеличение тока с записью электродом в этой позиции и обратите внимание на максимальный ток ответа (например, ~ 10-20 мкА). Наконец, используйте полумаксимальной интенсивности стимула для экспериментов (например, фиктивный управления периодической стимуляции). Определить порог синаптически вызвала SD (рис. 2). С электродов настроены, как описано выше для вызванные потенциалы поля, переключатель стимуляции парадигму единого вручную вызвало всплескииз 10 импульсов (10 Гц при 100 мкс / импульс), парадигма ранее применялся в целом исследования на животных. Постепенное увеличение силы тока на стимул взрыва до SD срабатывает. Подождите не менее 60-120 сек между стимулами. Доклад SD порог в кулонах (то есть, текущее время х). В других экспериментах, которые требуют измерения ответы на индукцию несколько СД, использование силы стимул может вызвать SD (например, ~ 100-500 NC). Триггер SD каждые 9 минут в течение часа. Обязательно используйте асептики всей экспериментов. После последнего SD, возвращение культуры вставить в нормальных условиях инкубации. Марк культуры блюдо отметить, что опытные культуры SD. Наша привычка к месту единого знака слева и две марки на право вставить срез культуры, отметив, каждый из трех культур, как № 1, № 2 и № 3 слева направо. Изменение среды каждые 3-4 дней, пока культура урожая. Для периодических SD, следовать процедурам, описанным выше. Как правило, мы тест на изменение SD порог 1, 3, 7 и 14 дней после начальной час несколько СД. СА3 области быстрого потенциал и медленный потенциал изменения записываются с помощью отдельных систем цифровой обработки сигналов. 2. Образцовый Vital изображений в гиппокампа культур фрагмент Динамический функциональное поведение резидента иммунные клетки (то есть, микроглии) Аналогичным образом можно контролировать в срез культуры без травмы клеток или иммунной активации (рис. 3) 9. Например, на этикетке микроглии, чтобы оценить их движение, связанное с изменениями синаптической активности SD, мы использовали флуорофора с метками isolectin-IB 4. "Лектин PBS" является PBS с дополнительными катионов (0,1 мм каждый CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2) так как двухвалентных катионов (0,1-1,0 мМ), обязательны для связывания лектина для α-D-галактозил остатков на микроглии клеточных мембран. Сделать решения "Лектин PBS": На 1 л PBS, используя асептики и стерильной фильтрации, добавьте: 100 мкл 1 М MgCl 2 100 мкл 1М MnCl 2 100 мкл 1М CaCl 2 Тщательно перемешать, чтобы объединить и держать в холодильнике при температуре 4 ° С. Только 500 мкл "лектин PBS" необходимо в пузырек isolectin, но так как он может храниться в холодильнике и держали в течение нескольких месяцев в то время, это может быть полезно сделать более крупные объемы. Развести AlexaFluor 594-меткой isolectin-IB4 (isolectin) лиофилизированный порошок ТО1 мг / мл в "лектин PBS". В целях минимизации фотообесцвечивания, выполните этот шаг как можно быстрее, сводя к минимуму воздействие света. Isolectin можно аликвоты по 20 мкл после разведения в 1mg/ml и хранится при температуре -20 ° С на срок до одного года. Развести isolectin до 20 мкг / мл в среде роста и инкубировать культур срез при нормальных условиях инкубации 4-10 часов до съемки. Изображениями настройки. Изображениями настройки состоит из: микроскоп, затвора, камера, свет, 2,0 фильтр нейтральной плотности, 36 ° С, газ: 5% CO2, воздух (или 20% кислорода, баланс азота). Включите микроскоп, камера, ультрафиолетовый свет, температурный режим, и газы, по крайней мере за час до съемки. Настройка Метаморф изображений протокола. С "Журнал" в раскрывающемся меню выберите пункт "Выполнить журнал …". Это должно побудить открытие ЖУРНАЛЫ папки, из которых вы должны выбрать "Движение со-уаг AFS (журнал ранее было установлено, что следующие шаги)", нажмите кнопку "Открыть". "Автофокус Частота" появится окно следующего, держать количество на 1, нажмите кнопку "OK". Далее Setup "последовательный файл Na …" Появится окно, сохранить все как есть: База Название: Изображение; Изображение Количество: 1; Количество Ширина: 3; Сохранить как Тип: Метаморф TIFF; если картинка уже существует -> Переписать автоматически; Нажмите кнопку "Select Directory …", это приведет к" Обзор папок "окно в окно. Здесь выберите папку (или создайте новую папку), где фильм кадры должны быть сохранены. Потом, когда нужную папку (например, C: \ Data \ New Folder), отображается в нижней части "Setup последовательный файл Na …" окне нажмите кнопку "OK". В Приобретать окна: Выберите настройки в левом нижнем углу, чтобы быть DiIMGBIN2; "Выдержка": 20 мс; "Биннинг": 1. Затем, в специальные вкладки: "Sensor Mode": FT; "Digitiзер ": 10 МГц (EM Gain); "Gain": Gain3 (3x); Выберите "Е. М. Усиление: 45"; Фотоаппарат Затвор: Открыт для Expose; Режим очистки: CLEAR PRE EXP; Открытый графом: 2, режим триггера & Live Mode Триггер: Normal (времени). "Рамки для Средняя": 3. Нажмите кнопку "Закрыть". После настройки Метаморф изображений, место вставки в 35мм блюдо культуры с двумя 1 мм стекло стержней в нижней части. Поместите три 2 мм куски резиновой трубки устанавливается между стенами вставки и культуры блюдо по дальнейшей стабилизации вставки. Место ~ 10 мм в ширину кусочка ваты пропитанные дополнительно 1 мл среды внутри вставки для поддержания увлажненной среде. Убедитесь, что он находится на одном уровне со стенами и от гиппокампа ломтиками. Обложка начало культуры блюдо сильно с поливинил хлорида фильм, чтобы предотвратить потерю жидкости. Убедитесь в том, что в центре внимания визуализации СА3 пирамидальных слоя клеток. Обратите внимание, ориентация среза, взяв фазы фотографии на 5x, 10x, 20x и. В "Найти Фокус" окно, которое появляется на экране, установите диапазон, тока + / – быть «8», и точность, в микрона (ы), который будет "1" (оба флажка в нижней части должна быть проверена) . Нажмите кнопку "Найти Фокус" для обеспечения в фокусе изображения. В "Приобретайте Timelapse" окно, выберите интервал времени, чтобы быть "1 минуты", и срок для "6 часов" (это наш партнер параметры сбора). Для точного захвата микроглии движений, изображения должна быть не реже, чем раз в минуту. В Хранение изображений, выберите Stack. Окно обновления изображения окна должны быть проверены, но не других двух коробок под ним. Выберите "Illum" быть "лямбда". Нажмите "OK". Фильм приступает к запуску. Это означает, что ничто другое не может быть выполнена в рамках программы Метаморф пока фильм не завершит работу или пока вы не прекратите фильм рано, нажав Esc, после чего фильм будет затем остановиться на следующем приурочен приобретение шаг. В конце фильма, проверьте повреждение клеток путем Sytox скрининга, как отмечалось выше (). 3. Добыча РНК для низкого уровня цитокинов сигнализации 11-15 Ранее мы представили подробные инструкции для обнаружения низкого уровня цитокинов сигнализации в срез культуры использованием КПЦР и методов ПЦР массива. 6,7 У нас заметно улучшилась чувствительность нашего подхода к мРНК цитокинов обнаружения в срез культуры и представить эти усовершенствования здесь. Усовершенствования включают наш подход к урожай ткани и РНК изоляции, prescreening образцов для фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) изменения, и кДНК preamplfication, которые ~ в 6 раз более чувствительна, чем предыдущие методы, и, например, разрешить обнаружение Впервые среза культуры гамма-интерферона (IFN-λ) обнаружение 15. ПЦР подготовки. Урожай фрагмент культуры. После экспериментов, вставляет срез культуры погружены в 2-3 мл РНК позже и хранить при температуре 4 ° С в течение 3 дней до дальнейшей обработки. Для уборки, удаления посторонних (то есть, любые ткани, прилегающих к гиппокамп собственной) ткани с использованием алмазов нож и снять ломтики на отдельные РНКазы / ДНКазы свободный 1,5 мл центрифужные пробирки, содержащие 0,5 мл стерильного фосфатным буферным раствором (PBS) с помощью тонкой наконечником краски кистью. Спиновые образцов (10 000 оборотов в минуту х 1 мин) в стереотипным способом так, все срезы придерживаться той же стороне их трубок. Удалить супернатант PBS и ресуспендируют образца в 500 мкл TRIzol. Магазин образцы при -80 ° C или держать на льду, пока добыча РНК. Выделения РНК usingTRIzol с RNeasy Micro результаты комплект в большей РНК выход (рис. 4), чем использование комплекта в одиночку. Оттепель TRIzol-образцов и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Диссоциируют ткани рисунок образцы вверх и вниз с 1 мл наконечником pippetor и / или вортексе до твердых тканей больше не видна. Добавить 100 мкл РНКазы бесплатно (РФ) хлороформа и инвертировать трубки 2-3 раза перемешать. Инкубируйте 3 мин при комнатной температуре, вортексе каждую мин. Центрифуга при 13000 оборотов в минуту в течение 15 мин при 4 ° C. Передача супернатант на чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Будьте осторожны, чтобы не нарушить интерфейс. Добавить равный объем комнатной температуре РФ 70% этанола молекулярной биологии класс (~ 300 мкл). Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Выполните следующие шаги в направлении RNeasy комплект Micro: Применить образца RNeasy микро колонке помещены в 2 мл Collectioн трубки. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 15 сек, отбросить проточные. Вымойте RNeasy колонку с 350 мкл RW1 буфера. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 15 сек, отбросить проточные. Добавьте 10 мкл ДНКазы 1 маточного раствора до 70 мкл RDD буфера, аккуратно перемешать. Применяют 80 мкл раствора ДНКазы непосредственно на мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Вымойте RNeasy колонку с 350 мкл RW1 буфера. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 15 сек, отбросить проточных и трубы. Добавить 500 мкл буфера для НПП RNeasy колонке. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 15 сек, отбросить проточные. Добавить 500 мкл РФ 80% этанола молекулярной биологии для класса RNeasy колонке. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 2 мин, отбросить проточных и трубы. Место RNeasy колонку в новой трубы с колпачками открытым. Центрифуга на полной скорости (то есть, 14 000 оборотов в минуту) в течение 5 мин. Передача RNeasy столбец трубки микроцентрифужных РФ. Применяют 14 мкл воды РФ непосредственно к мембране. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 1 мин для элюирования. Магазин образцы при -80 ° C или продолжать дальнейшие шаги. РНК количественного определения. Развести RiboGreen 1:200 в РФ 1x Трис-ЭДТА (TE) буфера. Подготовка дрожжевой тРНК, которые будут использоваться в качестве РНК-стандарта. Рабочий запас хранится в -20 ° C при 100 мкг / мл Развести до 1 мкг / мл (10 мкл в 990 мкл ТЕ). Создание стандартов следующим образом: Для 100 нг / мкл, добавьте 100 мкл, в течение 80 нг / мкл, добавить 80 мкл тРНК и 20 мкл ТЕ, в течение 60 нг / мкл, добавить 60 мкл тРНК и 40 мкл ТЕ, в течение 40 нг / мкл добавить 40 мкл тРНК и 60 мкл ТЕ, в течение 20 нг / мкл добавить 20 мкл тРНК и 80 мкл ТЕ, и при 0 нг / мкл добавить 100 мкл ТЕ. Подготовка образцов: Комбинат 99 мкл TE + 1 мкл образца. Выполнить каждого образца в двух экземплярах. Использование многоканальных дозаторов, добавьте 100 мкл разбавленного RiboGreen на лунку. Внесите вверх и вниз, чтобы смешаться. Мера флуоресценции на ридер. Флуоресцеина (485 nm/535 нм, 0,1 сек) программа. Экспорт результатов в электронную таблицу Excel. Определить концентрацию РНК. График впитывающей способности по сравнению с концентрацией РНК и создать наиболее подходящую линейной регрессии в Excel. Определить образец РНК концентрациях от уравнения регрессии связаны с наиболее подходящую линию. Определение РНК качества. Рибосомного группы РНК целостность измеряется через агарозном геле (рис. 4). Хотя это непрактично, чтобы запустить долю каждого образца РНК получены (с = 1 мкг РНК не требуется, и наши урожаи мало), это хорошая идея, чтобы периодически запускать денатурирующих агарозном гель на образцовое пример как доказательство того, что метод , когда сделано должным образом, дает высокое качество РНК (то есть без деградации). Подготовка 1% агарозном геле (на 100 мл объема). Чистая электрофореза бак, литье лоток и геля гребни тщательно РНКазой AWAY. Отвесить 1 г сверхчистых агарозы в колбу. Добавить 83 мл РНКазы свободной воды и 10 мл 10-кратным MOPS [3 – (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты] буфера и СВЧ до агарозном растворяется и раствор не станет прозрачным (~ 3 мин). Для того, чтобы 10-кратный буфер MOPS Комбинат 83,7 г MOPS, 13,6 г ацетата натрия и 3,7 г ЭДТА. Добавить 800 мл РНКазы свободной воды, перемешать, чтобы раствориться. Отрегулируйте рН до 7,0 и заполнить на 1 л Фильтры стерилизовать или автоклаве. Хранить при комнатной температуре в защищенном от света месте. Разрешить гель для охлаждения до 55 ° С и добавить 7 мл 37% формальдегида (это действие должно быть сделано в химический вытяжной шкаф). Вылейте гель в литье лоток и геля позволит укрепить в капюшоне. Подготовка РНК образцов. РНК образца буфера (500 мкл, сделать свежий). Комбинат 50 мкл 10x MOPS, 250 мкл формамида, 90 мкл 37% формальдегида, 108 мкл РФ H 2 O и 2 мкл бромистого этидия (исходный раствор 10 мг / мл). Для 1-10 мкг РНК, добавить удвоить объем использования образца буфера, в течение трех-кратного разбавления. Денатурации при 95 ° С в течение 5 мин, затем охладите на льду в течение 5 мин. Спиновые брiefly и загрузки полной выборки в скважины рядом с лестницей РНК (добавить загрузку краситель по желанию). Electrophorese Заполнить камеру с 1x буфера MOPS. Electrophorese на 50-75 вольт до маркеры мигрировали около 2/3rd длины геля. Визуализируйте гель на УФ transilluminator. Убедитесь, что Есть резкий 18S и 28S рибосомных РНК (рРНК) групп, и что группа 28S в два раза интенсивнее 18S полосы (рис. 4). Деградированных РНК будет иметь смазанный вид, нечеткие полосы, или не будет выставлять 2:1. Обычно мы используем оптической плотности оценить общее качество РНК. Хотя не так чувствительны, УФ-спектрофотометрии через Nanodrop является быстрым и экономичным средством для проверки качества РНК. Ищите оптической плотности (ОП) 260/280 отношение 1.5-2.0. Имейте в виду, что решение, в котором РНК ресуспендировали (TE буфера по сравнению с водой) будет влиять на соотношение ОД. ПЦР деятельности. Предварительно ПЦР установки Разрабатывать специальные грунтовки Использование Primerblast NCBI в http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ : Введите Refseq присоединения ген-мишень номер. Укажите ПЦР-продукта размером от 70 до 200 б.п.. Укажите Тт 55-72 °, с менее чем 5 ° разницу между прямой и обратный праймеры. Выберите "Грунтовка должна охватывать экзон-экзона узел", чтобы уменьшить геномной фоне. Включить специфики проверки Крыса Refseq РНК базы данных для обеспечения того, чтобы праймеры не признают дополнительные цели. Выбор пары праймеров из результатов, который соответствует следующим критериям: 18-30 оснований. Менее чем в 2000 базах друг от друга на шаблон. 40-60% гуанин-цитозин содержания для обеспечения стабильного связывания праймера для шаблона. Выбор ссылки гена. Не все ссылки ген будет подходящим для вашего Экспериментальная установка. Каждый раз, когда новая парадигма используется, стабильность вашей ссылки должны быть проверены. Для надежности, мы решили использовать один из четырех генов ссылкой предоставляется на RT 2 массиве Profiler ПЦР. Хороший ген ссылка должна соответствовать следующим критериям: Ее уровень экспрессии не меняется при экспериментальной парадигмы. Это выражается на уровне похож на ген-мишень. Чтобы выбрать подходящую ссылку: Обзор литературы для выявления вероятных кандидатов на стабильной генной ссылка в вашей системе. Например, мы проверили Rpl13a потому что это было показано, что стабильной в исследованиях ишемии. 11,12 Дизайн праймеров, как описано выше (или найти уже апробированы праймеров для общих генов ссылки в базе данных, как RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ). Оптимизация грунтовки наряду с праймерами гена-мишени (см. ниже). Определите, какой кандидат ссылка самых стабильных использованием программного обеспечения, как Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm), которая вычисляет стабильности значение для каждого гена на основе дисперсии внутригрупповых и выбирает ген (ы) с наименьшим выражение вариацию на образцы. Например, Rpl13a является оптимальным гена ведения SD (рис. 4). Оптимизация праймеров. Чтобы получить последовательные и надежные результаты КПЦР, грунтовки должны отвечать определенным критериям воспроизводимость, чувствительность и специфичность. Лучше всего, чтобы проверить эти параметры для каждой новой пары праймеров. Воспроизводимость проверяется на выполнив технические повторяет. Чувствительность может быть оценена производительность стандартной кривой последовательных 4-кратные разведения. Специфика определяется путем подтверждения одного продукта расплава анализа кривых и гель-электрофореза (рис. 5). Выполнить КПЦР пластины для проверки качества вашего грунтовки, и концентрации праймеров, которые будут использоваться. Использование кДНК синтезировали из цельного мозга РНК, создайте стандартную кривую (серию последовательных 4-кратные разведения) следующим образом: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, и никаких шаблонов управления (NTC) . Для каждого разведения, запустить 1 мкл кДНК в дублированияТе для каждой концентрации праймеров (т.е. 100 нм, 200 нм, 300 нм). Убедитесь, что технические повторяет дают согласующиеся значения Ct. Изучить Ct значения для разведения кривой. Участок Ct ценностей от концентрации для каждого из разведений. Результирующая графа должна быть линейной с хорошим коэффициентом корреляции (т.е.> 0,95). Изучить расплава кривой, чтобы подтвердить наличие единого продукта амплификации (то есть, один пик). Если Есть несколько вершин или пиков не похожи, это может свидетельствовать загрязнения, mispriming, грунт-димера артефакт, и т.д. (рис. 5). Пика в НТЦ, скорее всего, соответствуют грунтовки димеров, которые образуют с большей готовностью в отсутствие шаблона кДНК, и не должно быть проблемой. Подтвердите расплава кривой данных путем разрешения усиливается продукции на 1% агарозном геле. Подготовка 1% агарозном геле (на 100 мл объема) Отвесить 1 г агарозы в колбу. Добавить 100 мл 1x Трис-ацетат ЭДТА (TAE) буфера и СВЧ до агарозном растворяется и раствор не станет прозрачным. 1 л 50x TAE буфер состоит из 2 М Трис базы, 57 мл ледяной уксусной кислоты и 0,05 М ЭДТА (рН 8,0). Развести TAE буфер для 1x с дистиллированной водой (конечные концентрации: 40 мМ трис-ацетата и 1,0 мМ ЭДТА). Разрешить гель для охлаждения до 55 ° C перед добавлением бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг / мл. Вылейте гель в литье лоток и дайте ему затвердевают при комнатной температуре. Для запуска, место гель-электрофореза в камере, наполненной 1x TAE, объединить 10 мкл пробы из КПЦР пластина с 2 мкл красителя 6x загрузки, хорошо перемешать и загрузить в лунки вместе с молекулярным весом лестнице. Electrophorese на 50-150 вольт до маркеры мигрировали соответствующем расстоянии, в зависимости от ожидаемого размера вашего кДНК продукта. Визуализация с УФ transilluminator. Убедитесь, что усиливается ПЦР продукт имеет подходящий размер для вашей цели. Грунтовка димеров составит около 50 бп. Предварительно экран для увеличения ФНО-α. Так как TNF-α инициирует воспалительные реакции на периферии, мы подозреваем, что это же верно и для мозга и использовать первоначальный отбор для TNF-α мРНК в качестве маркера срез культуры иммунного статуса (то есть, нормальный, обман, и экспериментальные группы), прежде чем приступать для полного набора ПЦР анализа. Если нормальная и фиктивными контроль ФНО-α уровни мРНК не входят в круг interassay найти в нашей лаборатории, эксперименты (например, нормальное, обман, и экспериментальные группы), отбрасываются и не приступит к полный спектр ПЦР-анализа. iScript синтеза кДНК. Для каждого образца РНК, объединить в следующие ПЦР-пробирку: 4 мкл 5x смесь реакции, 1 мкл обратной транскриптазы, 25 нг РНК и РФ H 2 O до конечного объема 20 мкл. Осторожно перемешать с помощью пипетки и спином вниз кратко. Инкубировать: 25 ° C, 5 мин, 42 ° C, 30 мин, 85 ° C, 5 мин. Развести 1:4 (добавить 60 мкл РНКазы свободной воды). Хранить при температуре от -20 ° C или держать на льду пока не готовы к использованию в течение нескольких часов. КПЦР для TNF-α. Подготовка мастер микса для каждого праймера пары. Комбинат 12,5 мкл IQ SYBR зеленый, 1 мкл смеси грунтовки и 10,5 мкл воды в образце. Для обоих наших Rpl13a и ФНО-α грунтовки, 200 нМ является оптимальной концентрации. Настраивает количество грунтовки и объема сточных при необходимости, в 1,5 мл трубки микроцентрифужных РФ и держать на льду, в то время как вы создали пластинку. Настройка КПЦР пластины с элементами управления / Шамс / experimentals. Используйте 1 мкл кДНК на образец в двух экземплярах для каждого гена. Добавить 24 мкл твой хозяин смеси в каждую лунку и пипетку вверх и вниз, чтобы смешаться. Будьте очень осторожны, чтобы избежать пузырей, так как они будут мешать флуоресценции чтениях. Выполнить 40 циклов ПЦР-амплификации: 95 ° C, 8.5min; 40 циклов: 95 ° C, 10 сек, 60 ° С, 30 сек, 72 ° С, 20 сек / цикл. Растопить кривой: 55 ° С, 1 мин, 80 циклов шагом 0,5 ° С в течение 10 секунд каждый, начиная с 55 ° C. Анализ данных (ΔΔCt методом;. Рис. 4). 13 синтеза кДНК для массивов ПЦР. Рассчитайте объем (мкл) каждого образца иметь 250 нг РНК. Выберите количество РНК (100 нг до 1 мкг), которые можно последовательно извлечь из ваших образцов. RT 2 Аптечка первой Strand – в соответствии с инструкциями производителя. Кратко: Оттепель и спином вниз все реагенты. Для каждого образца РНК, объединить в следующие ПЦР-пробирку: 250 нг РНК, 2 мкл 5x геномной ДНК (gDNA) буфера ликвидации и водой до конечного объема 10 мкл. Осторожно перемешать с помощью пипетки и спином вниз кратко. Инкубировать при 42 ° С в течение 5 мин. Холод на льду в течение 1 мин. В то же время, подготовить обратной транскрипции (RT) коктейль (по образцу): Комбинат 4 мкл 5x РТ буфера 3, 1 мкл праймера и внешнего контроля смеси, 1 мкл фермента РТ смешайте 3 и 3 мкл воды. Добавьте 10 мкл коктейля РТ к каждому образцу и аккуратно перемешать. Инкубировать при 42 ° С в течение 15 мин. Остановить реакцию путем инкубации при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Добавить 91 мкл РФ H 2 O, чтобы каждый 20 мкл кДНК реакции синтеза (развести водой до конечного объема 111 мкл). Хорошо перемешать с помощью пипетки. Хранить при температуре от -20 ° C или держать на льду пока не готовы к использованию в течение нескольких часов. RT 2 Profiler ПЦР массива. Следующие инструкции следовать за теми, производителя и повторяются здесь для удобства. Подготовка реагентов Оттепель и спином вниз все реагенты. Подготовка экспериментальных коктейль: Комбинат 1350 мкл 2x SABiosciences RT 2 КПЦР SYBR Green Master Mix, 102 мкл разбавленного кДНК и 1248 мкл РФ H 2 O, чтобы окончательный объем 2700 мкл. Осторожно удалите PCR массив из запечатанном пакете. Разлить коктейль в загрузке водохранилище. Добавьте 25 мкл в каждую лунку с многоканальной пипетки. Тщательно печать ПЦР массива пластины. Центрифуга табличку на 10000 оборотов в минуту в течение 1 мин при комнатной температуре. Место на лед, пока программа ПЦР готов. Запустите соответствующую программу велосипедных для вашей машины. iCycler: 95 ° C, 10 мин 40 циклов: 95 ° С, 15 сек, 60 ° С, 1 мин. Растопить кривой: 55 ° С, 1 мин, 80 циклов 0,5 ° С шагом в течение 10 секунд каждый, начиная с 55 ° C Анализ данных. Выберите "Auto Расчетная» для базовых циклов. Выберите "User Defined" за порогом позицию, чтобы вручную установить пороговое значение. В "Log View", установить порог в нижней трети линейных фазы усиления сюжета. Не забудьте сохранить порогового значения одинаковы во трасс. Экспорт данных. Вклад в файл Excel. Загрузить на SABiosciences ПЦР анализа массива данных. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php Выберите ссылку гены – мы использовали Rpl13a. Наша практика заключается в следующем: Подтвердить результаты, по крайней мере дублировать массив ПЦР. 3-кратное изменение массива не обязательно должны быть подтверждены последующими конкретными усиления целевой ПЦР. 6,7 Менее чем 3-кратное изменения должны быть подтверждены последующими конкретную цель ПЦР-амплификации или использование 2-3 массивы ПЦР (для подтверждения 2x изменения. ДНК предварительного усиления используется для анализа целей с ожидаемыми сверхнизким выражении (рис. 6). RT SABiosciences в 2 Nano PREAMP кДНК комплект синтеза и грунтовки смеси предназначены для предварительного усиления РНК, позволяющий использовать в небольших количествах (1-100 нг) образцов РНК для запуска полного набора ПЦР. Каждый грунтовки смеси обеспечивает усиление 89 генов конкретного кДНК шаблоны цели с минимальным уклоном. Мы использовали эту систему как средство усиления сигналов низкого уровня, таких как IFN-λ к обнаружению уровня. RT 2 Nano PREAMP кДНК комплект синтеза – в соответствии с инструкциями производителя. Кратко: Оттепель и спином вниз все реагенты. Для каждого образца РНК, объединить следующие в ПЦР-пробирку. 1-100ng РНК, 2 мкл 5х буфера ликвидации gDNA и воды до конечного объема 10 мкл. Осторожно перемешать с помощью пипетки и спином вниз кратко. Инкубировать при 42 ° С в течение 5 мин. Холод на льду в течение 1 мин. </lя> В то же время, готовить коктейль РТ (по образцу). Комбинат 4 мкл 5x РТ буфера 3, 1 мкл праймера и внешнего контроля смеси, 1 мкл кДНК смесь синтез фермента, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3 мкл воды. Добавьте 10 мкл коктейля РТ к каждому образцу и аккуратно перемешать. Инкубировать при 42 ° С в течение 15 мин. Остановить реакцию путем инкубации при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Хранить при температуре от -20 ° C или держать на льду пока не готова к использованию. кДНК усиления с специфическими праймерами. Смешайте следующие в ПЦР-пробирку: 12,5 мкл PCR Master Mix, 7,5 мкл специфических праймеров и 5 мкл неразбавленного кДНК. Выполнить 12 циклов ПЦР. 95 ° C, 10 мин. 12 циклов: 95 ° С, 15 сек, 60 ° C, 2 мин. Держите при 4 ° C. Добавьте 2 мкл редуктор реакции стороне каждого образца. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин. Остановить реакцию путем инкубации при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Добавить 84 мкл воды РФ в каждом 27 мкл кДНК реакции амплификации. Хранить при температуре от -20 ° C или держать на льду пока не готовы к использованию в течение нескольких часов. Amplify отдельных целей гена использованием SAB грунтовки и SYBR зеленый мастер смеси, как описано выше. 4. Мультиплексный фосфопротеин Анализы цитокинов сигнализации Mutliplexed анализов фосфопротеин используются для определения цитокинов лиганд-рецептор вниз по течению сигнализации (рис. 7). Определить количество общего белка в срез культуры. Урожай срез культуры, осторожно подъема отрезает вставок и место в 1 мл холодного (4 ° С) PBS. Пробирки центрифужные на 30 секунд и снять PBS. Место на сухой лед, пока не закончено уборки урожая. Хранить при температуре -80 ° C. Однородный срез культуры для общего анализа белка. Подготовка буфера лизиса клеток в соответствии с инструкциями производителя. Добавить ингибиторы протеазы, чтобы общий объем буфера необходимо разместить не менее 200 мкл лизирующего буфера на каждый срез культуры. Например: добавить 20 мкл Фактор 1, 10 мкл Фактор 2 и 20 мкл 500 мМ PMSF в ДМСО до 4,95 мл буфера для лизиса клеток. Оттепель срез культур в 200 мкл буфера для лизиса на льду. Разрушать ультразвуком срез культуры в пять раз в 1 сек импульсов и место сразу же вернуться на лед. Vortex образцы на 10 сек. Центрифуга образцов при температуре 4 ° С в течение 15 мин при 13000 оборотах в минуту. Передача супернатант в чистую пробирку и хранить на льду. Выполните общий анализ белка. Подготовка белка стандартам. Развести фондовом бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка стандартов в пределах от 0-1000 мкг / мл разведенного в воде высокой чистоты для анализа белков ДСС. Расчет объема рабочего реагента необходимо в зависимости от количества образцов и повторяет. Например: (8 + 18 стандартов неизвестных образцов) х (2 повторяет один образец) х (0,2 мл рабочего раствора необходимо на лунку) = 10,4 мл общего объема необходимых для всех образцов загружены на микропланшетов. Круглый до 12 мл объем общего для обеспечения достаточного объема. При смешивании реагента с реагентом B для рабочего реагента, некоторые мутность может произойти, но должны исчезнуть в ближайшее время. Нагрузка 10 мкл образцов и стандартов на лунку. Нагрузка 0,2 мл рабочего реагента в скважины. Крышка с уплотнительной ленты и встряхивают в течение 30 секунд, чтобы смешаться. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Прохладный пластины до комнатной температуры (около 10 мин), прежде чем читать дальше ридер при 595 нм. Построить стандартную кривую с использованием Microsoft Excel с измеренными абсорбцию против ожидаемых концентраций. Хороший коэффициент корреляции равен или больше 0,98. Рассчитать белка концентрации в пробах использованием линейное уравнение выводится из стандартной кривой. Разбавьте образцы в буфере для лизиса на равные количества белка и хранить при температуре -80 ° С до готовности для дальнейшей обработки. Концентрация белка должна составлять от 200-900 мкг / мл в соответствии с инструкциями производителя. Выполните Мультиплекс анализа. Примечание: мультиплексированных анализов фосфопротеин принимать по 2 дней всего, чтобы закончить, с 1 часа после первоначальной настройки и загрузки пластин затем ночь incuшаг возмущения и дополнительных инкубации и промывания на следующий день. Карта, какие скважин будет содержать лизат которые в соответствии с листа в руководстве. Оттепель гомогенизированных образцов тканей и комплект лизатов при комнатной температуре, а затем поместить на лед. Принесите все буферы и реагентов представлены в комплекте до комнатной температуры (за исключением стрептавидином и бисером). Подготовка шарики для мультиплекс анализа. Обложка пробирки, содержащие связанные бисер с алюминиевой фольгой для защиты от света. Вихревые трубки в течение 5 секунд и держать на льду. Развести связаны бисером 1:50 в промывочный буфер. Каждая скважина должна содержать 1 мкл связанных бусины в 49 мкл промывочного буфера для общего объема 50 мкл на лунку. Калибровка вакуумный аппарат. Промыть пластины с 100 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Включите вакуум и всасывания лишнюю жидкость в течение 2-5 сек. Если полное удаление буфера занимает больше времени, или короче, чем 2-5 сек, отрегулировать клапан соответственно. Сухой нижней части пластины тщательно перед добавлением образцов. Vortex разбавленный связаны бисером на 5 секунд и добавить 50 мкл назначенным скважин. Сразу же вакуум-фильтра и сухой нижней части пластины с бумажным полотенцем. Промыть пластины в два раза с 100 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Сухой нижней части пластины после каждого мытья. Vortex талой образцы в течение 3 секунд и добавить 50 мкл назначенным скважин. Место уплотнительную ленту на тарелку и инкубировать в течение 15-18 часов тряски при 300 оборотов в минуту при комнатной температуре в защищенном от света месте. Вакуумный фильтр лишнюю жидкость и промойте пластину три раза по 100 мкл промывочного буфера. Сухой нижней части пластины после каждого мытья. Развести 1:25 обнаружения антител в промывочный буфер. Каждая скважина требует 1 мкл антител в общем объеме 25 мкл промывочного буфера. Место уплотнительную ленту на тарелку и защищенном от света месте с алюминиевой фольгой. Встряхните в течение 30 секунд, постепенно увеличивая скорость до 1100 оборотов в минуту. Продолжить тряски при 300 оборотов в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре. Вакуумный фильтр тарелку и вымыть три раза с 100 мкл промывочного буфера. Сухой нижней части пластины после каждого мытья. Хотя защита пластины от света, подготовить 1:100 разведение стрептавидин-PE с достаточным объемом, чтобы добавить 50 мкл на лунку. Защита решение от света месте. Vortex тщательно и добавить 50 мкл разбавленного стрептавидином-PE на лунку. Инкубируйте при встряхивании при 1100 оборотов в минуту в течение 30 секунд, затем 10 мин при 300 оборотах в минуту. Вакуумный фильтр буфера избыток прочь. Промыть пластины в три раза с 100 мкл буфера ресуспендирования на лунку. Сухой нижней части пластины после каждого мытья. Добавить 125 мкл буфера ресуспендирования в каждую лунку и встряхивают в течение 30 сек при 1100 оборотах в минуту. Сразу читать пластины или хранить при 4 ° C вдали от света в течение 24 часов. 5. Имитация и модуляции цитокинов сигнализации Рекомбинантные белки цитокинов (с носителем) используются для имитации изменения SD. Лиофилизированный белки (например, TNF-α) хранятся на срок до 1 года при температуре -20 ° C. После разбавления до исходного раствора с 0,1% бычьего сывороточного альбумина, аликвоты готовы, хранить при температуре -20 ° С, до использования в течение 3 месяцев. Любые манипуляции с ломтиком культур обновляются по меньшей мере каждый третий день. Цитокинов сигнализация подавлен: Использование традиционных сигнальный каскад цитокинов фармакологических средств; Использование растворимых антагонистов лиганд [например, растворимый рецептор ФНО 1 (как описано выше для рекомбинантных лигандов)], или Генов [то есть, малых интерферирующих РНК (миРНК)]. Доставка миРНК, чтобы нервные клетки зачастую проблематично. Общие основе липидов реагенты обычно приводит к низкой эффективности трансфекции и потере жизнеспособности клеток. Вместо этого мы используем Thermo Scientific в Dharmacon ACCELL siRNAs, которые позволяют высокой эффективности нокдаун без использования реагентов трансфекции. Здесь мы показываем, нокдаун циклофилина B, несущественные белок экспрессируется во всех типах клеток, в качестве подтверждения использования этого метода в срез культуры. Доставка протокол был адаптирован для срез культуры от инструкции производителя для использования в прилипшие клетки. Развести 5x буфера миРНК для 1x РНКазой свободной воды. Подготовка 100 мкм решение миРНК в 1х буфере Циклофилина B миРНК предоставляется на 5 нмоль. Ресуспендируют в 50 мкл буфера для 1x 100 мкМ акций. Смешать с миРНК ACCELL доставки mediuм до конечной концентрации 1 мкм миРНК. Добавить 11 мкл 100 мкМ миРНК акции до 1100 мкл ACCELL доставки среду в 6-луночный планшет. Место в инкубаторе и позволить, чтобы уравновесить температуры к нормальным условиям инкубации в течение не менее 20 мин. Использование BSL-2 капот и стерильных, передачи вставляет в доставке смеси содержащие скважин. Инкубируйте с доставкой смеси в течение 96 часов для белка нокдаун. Оценка белка нокдаун путем иммуноблоттинга или усиление иммунной окраски. Западные кляксы, в то время как потенциал первого выбора для нокдаун эффективности, может быть слишком нечувствительными для низкоуровневой иммунной сигнализации связанных с не-вредно явление УР. Соответственно, мы следовали отрицательные Западной измерений пятно с серебряными расширенной диаминобензидина (DAB) иммунной и компьютерной денситометрии измерений (см. ниже). 6. Протеомных Подтверждения Сотовые специфику фосфопротеин изменений устанавливается с помощью иммунной окраски. 6,7 Fix срез культуры в течение 24 часов с фиксатором ПЛП, состоящий из: 10 мл 16% параформальдегида, 1,096 г лизина, 0,42 г фосфата натрия и 0,17 г натрия периодатом, заправляемого в общем объеме 80 мл с особо чистой воды (фиксатора составляет 6,2 рН). После 24 часов, аккуратно удалить срез культуры от вставками с тонкой кистью и трансфер в PBS, содержащие азид натрия (100 мг / л) до готовности разделе. Затем, инкубировать ломтиками по крайней мере 24 часов в PBS-20% сахарозы, вырезать целые культуры ломтик до 20 разделов мкм, и присоединится к геля покрытием слайды. Флуоресцентные иммуноокрашивания (например, для NFkB) осуществляется следующим образом со всеми шаги связаны с встряхивании при ~ 50 оборотов в минуту. Промыть срез культуры в 3 мл PBS три раза в течение 10 мин. Место слайды с установленными 20 мкм срез культуры в банках Коплин с ~ 40 мл PBS для всех промывания. Промыть срез культуры в PBS в три раза, 10 минут на мытье. Поместите несколько капель SFX сигнала усилителя на срез культуры и инкубировать во влажной камере в течение 30 мин. Инкубируйте срез культур в течение 2 часов при 37 ° С с кроликом анти-NFκβ антитела при 1:100 разводят в 0,75% Тритон Х-100 в PBS. Внесите раствор антитела непосредственно на ломтики. Удалите ломтики из раствора антител и мыть три раза в PBS в течение 10 минут на мытье. Инкубируйте ломтиками при комнатной температуре в течение одного часа в козьего анти-кролик AlexaFluor 594 антител в 1:50 в 0,75% Тритон Х-100 в PBS. Центрифуга AlexaFluor 594 антител в течение 15 мин при 10 000 оборотов в минуту, чтобы удалить осадок, который, возможно, сформировались в растворе. Вымойте три раза PBS, 10 мин на помыться. Dip слайдов в дистиллированной воде, чтобы смыть любые соли из ФСБ. Покровное с Продли antifade средних и дайте высохнуть в течение не менее 2 часов, покрытый от света месте. Визуализация с традиционными или конфокальной (рис. 7) флуоресцентной микроскопии. Белки производства меняется от миРНК нокдауна может быть чувствительно оценивается повышение традиционных DAB иммуноокрашивания 7 через интенсификацию серебра 16 и последующие денситометрических количественной (например, как показано здесь циклофилина B) (Видео рис. 2). Иммуноокрашивание для циклофилина В следующем стандартные процедуры для ярких изображений поле, мы недавно подробно, 7 с помощью: Анти-мышь циклофилина B (1:100) в течение 24 часов при температуре 4 ° С; Вслед за пероксидазой хрена вторичной маркировки антител (1:100); И DAB визуализации. е DAB реакции слишком слабы, чтобы цифровой денситометрических quantification17, они могут быть активизированы с дифференцированным процедуры серебра в соответствии с Куинн и Graybiel 16. Увлажняет слайды, а затем тщательно вымыть х 3 в течение 10 минут в высокочистой воды. Место слайдов в высокочистой воды в банку Коплин и теплой до 56 ° C. Подготовка аммиачный раствор нитрата серебра (0,5%): Сток хлорида аммония (25-30%) является только что разбавленный (1:1) с высокой чистоты воды. Добавить гидроксида аммония (~ 500-600 мкл на 100 мл) по каплям при перемешивании до 0,5% раствор нитрата серебра который кратко остановиться облачно и затем снимите. Теплый раствор до 56 ° C. Инкубируйте разделы на 10-12 мин. Вымойте слайды на 15 секунд в воде высокой чистоты (эта и все последующие шаги выполняются при комнатной температуре на Коплин банки). Dip слайды на 15 сек в 1% тиосульфата натрия (пентагидрат). Dip слайды на 15 секунд в высокой чистоты воды. Тон слайды в течение 2 мин в 0,2% золота хлорида. Dip слайдов в высокочистой воды в течение 15 сек. Expose слайды до 0,5% щавелевой кислоты в течение 2 мин. Dip слайды на 15 секунд в высокой чистоты воды. Лечить слайды в течение 5 мин в 5% тиосульфата натрия. Вымойте тщательно слайды с высокой чистотой воды, обезвоживания и покровное. Слайды готов к денситометрических количественное 17. Все оборудование, в том числе яркого освещения поля, включен по крайней мере 20 минут до съемки. Всего разделов культуры ломтик отображаеются с 5-10x на инвертированный микроскоп. Интенсивность света установлен на едином уровне (например, ~ 2,6 В) и не изменились на протяжении всего изображения приобретений. Нейтральные фильтры используются в качестве необходимых для снижения полный проходящего света интенсивностью до ~ 1500 на 12-битных масштаба (0-4095), где "0" полностью черный и 4095 полностью белым. Цифровые изображения потом приобрел и хранятся в электронном виде для всех (то есть мнимого контрольной и опытной проб), в том числе фоновое изображение произвольной форме области слайд без разделов срез культуры. Фоновое изображение вычитается из всех изображений (притворство и экспериментальные) и области интересов (AOI) обращается вокруг каждого кусочка культуры и проходящем свете интенсивности зарегистрированы. Диапазон интенсивности изображения установлен на постоянной диапазон для всех экспериментах. Для ясности, результирующая выражается в виде относительной плотности по сравнению с контрольными уровнями (рис. 8). 7. Представитель Результаты: Рисунок 1. Фрагмент культуры электрофизиологические записи парадигмы. Запись микроэлектрода сначала помещены в СА3 пирамидальных нейронов слоя, а затем биполярного стимулирующий электрод помещается в зубчатой ​​извилине (ГД). Рисунок 2. СА3 вызвала потенциалов поля и синаптически индуцированных распространяющейся депрессии. () Эксперименты начинаться с определения текущих необходимых для максимального стандартного СА3 области потенциала поля ответов, а затем половину максимальной интенсивности используется, чтобы вызвать СА3 области вызванные потенциалы поля. Этот документ нормальной вызванных синаптических ответов между препаратами. Если поле ломтик в возбуждающих сообщение синаптических потенциалов не менее 3 мВ, ломтики, отбрасываются. (Б) Далее, транс-синаптически вызвала порог срабатывания распространяющейся депрессии определяется (справа, медленные ответы) и в то же потенциалы поля времени (слева , быстрые ответы) используются для документа, который препаратов достаточно здоров, чтобы следовать 10 Гц стимуляции (например, амплитуда вертикальных отклонений в быстрых потенциальных записей подобное). Рисунок 3. Микроглии движения связано со снижением синаптической активности. Опыт показывает, что микроглии отраслей расширить и убрать с повышенным синаптической активности, но междугородной движение этих клеток в ответ на синаптическую деятельность не была описана в неповрежденной мозга. Наши результаты с помощью флуоресцентного isolectin B4 маркировки микроглии показывают, что доля этих клеток перемещаться на большие расстояния при нормальных условиях. Кроме того, количество этих путешествий микроглии значительно увеличивается при синаптической активности устраняется культурой воздействия тетродотоксин, как показано в прилагаемом изображении. Красные линии марки пути пройденного микроглии в течение 6 часов с синими стрелками маркировки происхождения несколько примерных микроглии. Калибровка бар, 50 мкм. Рисунок 4. Деятельности ПЦР скрининг. () Мы используем TRIzol вместе с Qiagen комплекты для изоляции РНК, так как в наших руках, это приводит к значительно больше (P <0,001; т-тест). РНК выход из гиппокампа культур срез того, чтобы использовать наборов Qiagen в одиночку (B) Кроме того, мы периодически подтверждают, что наши процедуры выделения РНК производить высококачественные нетронутыми РНК, как это определено с помощью геля, который показывает резкие полосы РНК. (С) мы используем NormFinder программное обеспечение, чтобы выбрать ссылку ген с лучшей стабильности стоимости. Например, ломтик культур подвергаетсяк lipopolyssacharide (100 нг / мл в течение 2 часов), были проанализированы в течение трех ссылкой генов (Rpl13a, β-актин, 18 лет). Ct значения используются для расчета стабильности стоимости. Наши данные здесь [и что для других экспериментов с использованием распространяющейся депрессии (данные не приведены)] показывают, что Rpl13a является оптимальной гена ссылки. (D) Мы используем "ΔΔCt" метод в качестве чувствительного и воспроизводимого средства для выявления раз-изменение РНК различий между экспериментальными группами и фиктивными элементами управления. Рисунок 5. Проверка реакции ПЦР. () Мы измеряем амплификации кривой разведения для грунтовки, как средство для проверки качества реакции ПЦР. Например, оптимальная амплификации показать равномерную (1-5) увеличение порогов Ct. (Б) В отличие от усилений не однородны с плохой грунтовки (1-5). (С) Кроме того, мы выполняем расплава кривой Заключение ПЦР чтобы подтвердить, что желаемый ампликонов обнаруживаются (то есть, одной кривой пик), что указывает на отсутствие каких-либо двухцепочечной ДНК, включая грунтовку димеров, загрязняя ДНК и misannealed ПЦР-продукта (который будет выглядеть как несколько кривых пик). Рисунок 6. Nano предварительного усиления позволяет обнаружить ИФН-λ в гиппокампе культур срез. Так как только ~ 50 Т-клетки находятся в срез культуры (из ~ 55,000-90,000 клетки общего числа), мы использовали RT 2 нано PREAMP кДНК Kit синтез как средства для выявления потенциальных ультра-низким уровнем экспрессии ИФН-λ. Это означает, кДНК предусиления при условии 12-кратное увеличение чувствительности к РНК уровнях. Результаты, приведенные выше иллюстрируют возможности предварительного усиления увеличить чувствительность обнаружения. Ct порог для справки гена Rpl13a составила 20,5 с начальной усиления и это была увеличена до 14,1 с использованием предварительного усиления комплект, 12-кратное увеличение соответствующих 12 циклов ПЦР-амплификации кДНК. Параллельно с этим, ИФН-λ не была обнаружена (0.0), но в пределах дальности обнаружения (29,0) с предварительного усиления. Рисунок 7. Врожденный цитокинов путем изменения фосфопротеин фосфорилирования. (А), образцовый эффект ФНО-α предварительной обработки (например, нейропротекция) на врожденные цитокинов пути фосфопротеин фосфорилирования 24 часа после травмы excitotoxic в гиппокампе культур срез. Результаты показывают, СА1 области изменения между ломтиками предварительно в течение 3 дней с 100 нг / мл, ФНО-α до воздействия N-метил-D-аспартата (NMDA) по сравнению с теми подвержены NMDA-одиночку (т.е. экспериментальные против мнимого), выраженная в процент. Обратите внимание, что TNF-α индуцированных устойчивый рост фосфорилирования в JNK и ATF-2, а также временное повышение NFκB. (B) пространственное распределение NFκB активации (то есть, наличие фосфорилированных NFκB в ядре) раскрывается иммуноокрашивания ( красный). YoYo пятна ядер зеленый слой сечения культуры [например, в астроциты (стрелки)]. Пирамидных нейронов, которые в противном случае также появляются зеленые, желтые, вместо этого из-за сопутствующих маркировки фосфорилированных NFκB (красный). Калибровка бар, 25 мкм. Рисунок 8. . Протеомных подтверждение миРНК эффективности дифференцированных интенсификации серебра пероксидазой диаминобензидина основан иммуногистохимическое циклофилина В показывает, что миРНК может значительно (P <0,001; ANOVA-Холм-Сидак метод) уменьшение глобального гиппокампа ломтик циклофилина B выражения 3-х дней после применения 200, 500 , или 1000 нм миРНК.