拡散うつ病を使用してエピソードと慢性片頭痛の神経免疫シグナルのモデリングインビトロ</em

いくつかのポイントは、脳切片における免疫関連SDシグナリングの成功した研究のために強調する価値があります。最初に、開始刺激は同期SDを開始するために灰白質の脳の十分な容積を脱分極必要があります。これは1,2番目、急性脳スライスがSDを維持する。インターフェイスコンフィギュレーション（スライス培養インサート上にのみ下すなわち、流体の暴露およびガス交換）が必要とされることを意味しますが、その準備から外傷だけでなく、95％の酸素を使用すると、通気リンゲル液は、神経回路の機能と免疫恒常性を変化させることができる、それぞれのプロ炎症性変化とてんかん様の動作を生成する。3第3は、海馬のスライス培養ではこれらの急性スライスの限界を克服しながら、それは、スライス培養をする前に十分な期間維持しなければならないことに留意することが重要です。ミクログリアとアストロサイトが休止になるように（すなわち、in vitroで 10日間以上）使用してください。3-5最後に、SDは滅菌と無菌操作を用いて誘導する必要があります。以下に概説するテクニックは、このニーズを満たすように設計されています。 1。スライスの文化に拡延性抑圧文化の準備およびメンテナンス。 スライスの培養物は、以前にメディアに若干の修正を含む8に記載馬血清ベースの培地または無血清培地（SFM）6,7で準備し、維持されます。インキュベーションのパラメータは、36 ° C、5％CO 2、95％湿度バランス空気です。 我々は、文化がin vitroで 18日後にSFMに切り替えて、余分なカルシウムとマグネシウムを含む私たちの以前に定義されたSFMを使用することにより、in vitroで少なくとも35日前に維持できることがわかります。 さらに、antifungicide抗生物質とは、複数のレコーディングのエピソードに関連付けられている感染症の汚染を防ぐために追加されます。 この長期的な（または記録）メディアの製剤が含まれている（100mL当たり）：Neurobosal培地、97 mLの、宝石- 21、2.0 mLを、グルタミン（200 mM）を、0.5mLの、ゲンタマイシン（10 mg / mL）に、1​​0μL; D -グルコース（45％）、680μL、アスコルビン酸（0.5 M）、100μL、Fungizone、（250 mg / mL）は、400μL、食塩（5.0 M）、820μL、マグネシウム2 Cl 2中 （1.0 M） 、μL80、 塩化カルシウム（1.0 M）、160〜240μL。 培養物は、in vitroで 21から35日からSDに使用されます。 活力の検証。3,6,7 培養物は、使用前に錐体神経細胞死の証拠のためにスクリーニングされる。 in vitroで 18日で、挿入は5μMSYTOXグリーン、それはDNA（すなわち、死細胞に侵入することによって）にバインドしたときに蛍光になるマーカーを含む培地中で20分（通常の培養条件の下で）インキュベートする。 インサートは、以前のメディアに転送し、CA3やCA1錐体ニューロンの層の損傷の証拠のための蛍光顕微鏡（504励起、523放射）で検討されています。 20以上の細胞または250 IUを超えて蛍光の標準化レベルでのスライスは今後の使用から除外された。 材料の製造。 接地電極はガラス管（2.0 mm外径/ 1.16ミリメートルのID）で作られています4.5 mmの長さにカットして短く、両端で研磨起動。 我々は一年以上も続くことができる時に約20の電極を、行う。 沸騰に1M KClの100mLのを持参し、透明な黄色の溶液を生成するために攪拌し、3.5 gの寒天及び0.5gのEDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物）を、追加。 ガラス管と同様にフレキシブルチューブに短い距離に暖かい塩化カリウム/寒天ソリューションを描画するために、各ガラス管に装着フレキシブルチューブの短い長さを使用してください。 リリース吸引およびKCl /寒天は、ガラス管の開放端からゆっくりと滴下することができますし、次に氷の一部に対してオープンなガラス管の先端を保持する。 後者の操作は、電極チップでゲルに寒天をプロンプトし、ガラス管に戻すまで後退後のゲルれません。 寒天は、冷たい水道水でゲル化した後、フレキシブルチューブをガラス管に配置された寒天を変更することなく削除することができます。 場所は0.5〜1.5 mL遠心チューブのラックの各ウェルに1 M KClの添加。その後、個々のウェルの各寒天/ KClを充填されたガラス管の一方の先端を配置。 次に、止血鉗子で15ゲージの銀線の80 cmの長さを保持し、カウンタートップに開催されたエメリーボードを介して線を削って四辺のそれぞれをきれいに。 4cmの長さにワイヤーをカットし、洗浄とメッキ表面上の会社のAg – AgCl電極のコートを配置する20〜30分のための漂白剤で満たされたシンチレーションバイアルに入れます。 半分に各ワイヤを曲げるとWi充填されたガラス管の一端に自由端を挿入します。番目のKCl /寒天、露出4〜6ミリメートル程度残して。 最後に、コート銀線や乾燥からのKCl /寒天を防ぐために、余計な皮とワイヤーの小さな範囲、耐水性と柔軟性のある接着剤を、含有するガラス管のシャンク。すべての電極のために繰り返します。接着剤は一晩乾かします。 4に電極を保管°〜5 mLの1 M KClと著しく細菌の増殖を遅らせるEDTA、25 mgを含むシンチレーションバイアル中のC（5-6電極/バイアル）を。 フィラメント（ビデオの図1）とホウケイ酸ガラス管、 記録電極は、1.5 mmの直径（10cmの長さが0.86ミリメートルのID）から作られています。 鋭いポイントに引っ張ら短いガラス管の微細先端に微小電極を引き出します。 我々は一般的に1cmのテーパーと電極〜長さは7.5センチメートルを引き出します。これは、適切なポジショニングと電極の先端の可視化が可能になります。 電極はナリシゲPE – 2プラーでプルアップされています。 微小電極の先端は、校正済み光マイクロメータを装備した複合顕微鏡を用いて可視化の下で2〜4程度に戻って分割されます。我々は穏やかに微小電極の先端を破るために別の3次元マニピュレータが保持している油圧式一次元マニピュレーターに接続されている標準的なグラス組織のスライド（25 × 75 × 1 mm）のエッジを使用してください。 最初に、電極は粘土を使って顕微鏡スライドに取り付けられたマウントされています。 その後、スライドガラスの端の近くに微小電極の先端を移動するために使用される顕微鏡のスライドホルダーに配置される油圧マニピュレータに接続されて下落した。 最後に、微小電極の先端を穏やかに油圧駆動顕微鏡のスライドの端にそれを押すことで分割されます。 刺激電極は、ワイヤのバイポーラ電極を理由ねじれている。 彼らは、そうでない場合は単極刺激からの刺激のアーチファクトで隠されてしまう誘発電場電位、の記録を可能にする。 双極刺激電極を穏やかに鋭い先端バイポーラ電極とは異なり、怪我なく、歯状回の表面に適用することができます。 最後に、印加電流は電極に使用するテフロン絶縁電線の横（裸の）円形の表面に局在している。 とテフロンコーティングワイヤ、刺激電極の製造は、プラチナイリジウム（200μmのコーティングされた直径125μmの裸の直径）の〜20 cmの長さを切断することから始まります。その後、半分の長さを曲げ、ワイヤーの端に結び目から〜2センチ残して、緩い本結びに緩い端を結ぶ。 テーブルに置かれた電動ハンドドリルのチャックで結び目を固定します。 ワイヤーがしっかりとツイストになるまで、止血剤とワイヤーのもう一方の端を保持している間、一時的に（すなわち、それぞれの切断面は線が白紙に戻ることなく横方向に切断され、他から等しい距離になるドリルのオンとオフ）。 次に、白金イリジウム、ツイスト線のむき出しの端は、刺激アイソレータへの刺激電極を接続するために使用するリード線に接続する必要があります。 これは、〜50センチメートル30ゲージのワイヤに白金イリジウム線のはんだ付けの自由端によって行われます。 最初に、テープ白金イリジウムは、ベンチの上に線をツイストし、撚線のいずれかの自由端の上に濃塩酸の水たまりをドロップします。 次に、ワイヤーカッターを使用して各ワイヤから絶縁体の約1cmはがします。 ツイストペア線の端に隣接するリード線の被覆をはぎとった端を置き、2本のワイヤがしっかりと接続されるまではんだその後、先の細いはんだごてからの熱を適用する。 むき出しになったワイヤの接続を介して熱収縮チューブの小さな長さをスリップし、それが熱に合う縮小。 本目のワイヤについて、この手順を繰り返します。 15センチメートルパスツールピペットの先端を研磨し、ツイスト突出の約6cmになるまでピペットダウンツイストペアプラチナイリジウム線を導く発射。 電極の両端を密封するために撥水エポキシ（例えば、JBウェルド）を使用してください。 最後に、刺激アイソレータへの接続用リード線の両端にバナナプラグを取り付けます。 立体的な観察下に、PBS中の電極の先端を配置し、電極の先端の唯一の切り口からの電解生成された気泡を探します。いずれかの泡が撚り線の両側から来る場合、再確立無傷の絶縁にワイヤーの長軸に新鮮な単一エッジのカミソリの刃を使用して横カットで電極をカット。 異常な刺激の効果を解決するトラブルシューティングを行うときは、新鮮なカットの電極チップを作ってみてください。 録音の料理は、構成されています約1.0センチは離して間隔をあけ2つの1.0 × 12 mmのガラス棒に座っている35mmの培養皿でのシラミの文化インサート。ガラス管を加熱してから、ピンセットでベースにそれらを押すことにより、料理のベースにガラス棒を取り付けます。 静的記録条件については、シャーレに培地を1.5 ml加え。 次に、培地1.0mlに滅菌綿の約10 mmの幅および3-4 cmの長さの部分を浸す。長軸に沿って半分に綿を折ると滅菌ピンセットで挿入時にインナーも一緒に入れてください。ウェットコットンでは料理の湿度を維持するのに役立ちます。 チューブの三圧縮4mmの長さが均等にインサート周りに離間している。 ガス交換を可能にするポリ塩化ビニルフィルム、と緊密に皿に蓋をする。 過剰なポリ塩化ビニル膜を除去するために、単一のエッジのカミソリの刃との半ばに垂直な壁の周りにカット。 電気生理学的セットアップスライス培養インサートアセンブリは、電気生理学的記録のためのPDMIの録音室に配置されます。 PDMIチャンバー内に挿入/文化皿アセンブリは、必要に応じて記録電極、培地の流入/流出管、等のために配置さまざまな小さな穴で、PDMI室に付属している厚さ2mmのプラスチック製のディスクで覆われている我々は定期的にT熱電対プローブが7.3 pHと36.0 ° Cの条件を確保するために密封された半微小電極にマウントされているミニチュアタイプミニチュア複合pH電極と温度と培地のpHを監視します。 インサート/チャンバーは、5％二酸化炭素バランスの空気と培地は、静的または35〜36で開催されたインサートの中心にある流れ（1.2 mL /分）の構成で開催される℃で曝気されフロー条件については、培地を36で記録室の中央を保つために再び、インラインヒーターで暖めている℃に圧力リリーフと蠕動ポンプシステムは、ポンプから脈動することなくスライス培養ににメディアをもたらします。 PDMIチャンバーに付属の吸引器が優しく吸引を経由してインサートから培地を除去するために使用されます。 安定性を確保するため、チャンバーは倒立顕微鏡を保持し、振動のないテーブルの上に座っている特別に設計されたバーレイ-ジブラルタル倒立顕微鏡のステージ上にマウントされています。 小さな穴は小さく、バッテリ駆動焼灼ツールを使用してポリ塩化ビニルのインサートラップを通して開かれます。 次に、フローの設定が使用される場合、入口と出口の流量は、接地電極の配置が続く、開始されます。そうでなければ、単に場所の接地電極を置く。 マイクロマニピュレータと場所で開催された電極は、、ちょうど5倍の倍率（ 図1）で倒立顕微鏡で可視化スライスの上に配置されている。 刺激電極に続く記録電極から始まります。 我々は、微小電極は、スライスに接触する際に注意するオーディオモニタを使用してください。先端はCA3錐体細胞体層に沿った中間点に位置している。 録音が開始され、その後、刺激電極を優しく歯状回の中間点の表面に触れている。 両方のインスタンスでは、最初の電極の動きは、その細胞体層が容易に識別できるように位相コントラスト照明を使用して油圧、細かいコントロールと粗コントロール、および最終的な位置決めを実現している。 直接顕微鏡可視化の下で〜25μm刻みで電極を進める。 一度の電極は、電極に別の20から30ミクロンを進め、組織をタッチします。 刺激電極は、これはSDを（すなわち、機械的刺激を介して）トリガしない一定になる場所に置かれる前に録音が開始されています。 実験が開始される前に〜10分が経過するのを許可されています。 Transynaptically SDを誘発した。 Optimize（最適化）（ 図2）次のようにCA3電場電位を誘発。 CA3フィールド電位が応答（例えば、〜1-5μA）を引き起こすのに十分な電流を100マイクロ秒パルス（0.2 Hz）を始めと誘発されています。 フィールドのポテンシャルが最大になるまで、錐体ニューロンの長い軸に沿った単位で記録電極を移動します。 その後、この位置で記録電極で電流を増加し、最大の電流応答（例えば、〜10月20日μA）に注意してください。 最後に、（例えば、偽の制御周期的な刺激）実験のために最大値の半分の刺激強度を使用してください。 シナプス誘発SD（ 図2）しきい値を決めます。 電極として誘発電場電位のために上記の設定された、シングル、手動で誘発バーストに刺激パラダイムを切り替えるの10パルス（10 Hzの@ 100μ/パルス）、以前に全体の動物実験に適用されるパラダイム。 SDがトリガされるまで、徐々に刺激のバーストあたりの電流強度を増加させる。刺激の間に少なくとも60〜120秒を待ちます。 クーロンのレポートSDのしきい値（すなわち、現在のxの時間）。 複数のSDの誘導に応答を測定する必要とする他の実験では、SDを呼び起こす可能性が高い刺激強度を使用する（例えば、〜100から500 NC）。 時間のためのトリガーSDは、すべて9分。 実験を通して無菌技術を使用してください。 最後のSDの後に、通常の培養条件に文化のインサートを返します。 SDを経験した文化を注意することは培​​養皿をマークします。 私たちの習慣は、左から右へ＃1、＃2、＃3のように3つの文化のそれぞれを指摘し、スライス培養インサートの右に左にと二つのマークに、単一のマークを配置することです。 文化の収穫までは3〜4日毎に培地交換。 再発SDの場合は、上記の手順に従ってください。 我々は通常、複数のSDの初期時間後にSDしきい値1、3、7、および14日間の変化をテストします。 CA3領域、高速性と遅い潜在的な変更は別々のデジタル信号処理システムを経由して記録されます。 2。海馬スライス培養における模範的なバイタルイメージング常駐免疫細胞（すなわち、ミクログリア）の動的な機能の動作は、同様に細胞の傷害または免疫活性化（ 図3）ことなく、スライス培養で監視できます。9 例えば、SDのシナプス活動の変化に関連付けられている彼らの動きを評価するためにミクログリアにラベルを付けるために、我々は、蛍光タグ付きイソレクチン- IB 4を使用。 二価陽イオン（0.1〜1.0 mm）をミクログリアの細胞膜上のα- D -ガラクトシル部分へのレクチン結合することが要求されるので、"レクチンPBSは、"追加のカチオンを含むPBS（0.1mMの各のCaCl 2、MgCl 2を 、MnCl 2を ）です。 "レクチンPBS"のソリューションを作成します。 1 LのPBSの場合、無菌テクニックと滅菌ろ過を使用して、追加します。 1M MgCl 2の100μL 1M MnCl 2を100μL 1M CaCl 2を100μL ℃を結合し、4℃冷蔵保存する充分に混和 "レクチンPBS"の唯一の500μLをイソレクチンのバイアルごとに必要とされるが、それは一度に数ヶ月間冷蔵して保管することができるので、より大きなボリュームを補うために役に立つかもしれません。 再構成AlexaFluor 594 -タグ付きイソレクチン- IB4は（イソレクチン）"レクチンPBS"で粉TO1 mg / mLにして凍結乾燥。 退色最小限にするためには、光の露出を最小限に抑え、可能な限り迅速にこの手順を実行します。 イソレクチンを20μLに小分けすることができます一度に1mg/mlで再構成し、最長1年まで-20℃で保管。 増殖培地中で20μg/ mLまでのイソレクチンを希釈し、40〜10時間イメージングの前に通常の培養条件でスライス培養をインキュベートする。 イメージングは​​、設定する。 顕微鏡、シャッター、カメラ、ライト、2.0中立密度フィルタ、36 ° C、ガス：5％CO2、空気（または20％酸素、バランスの窒素）イメージングでは、セットアップで構成されています。 顕微鏡、カメラ、UV光、温度制御、およびガス像の前に少なくとも1時間電源をオンにします。 MetaMorphイメージングプロトコルを設定します。 "ジャーナル"のドロップダウンメニューから、ジャーナルの実行"を選択…". これは、"モーションW – VAR AFSを（ジャーナルは、以前に以下の手順に従うことが確立）"を選択してください、そこから雑誌のフォルダ、の開放を要求することを、"開く"をクリックします。 "オートフォーカスの周波数"ウィンドウは、次のポップアップ表示されます、1から番号を維持、"OK"をクリックします。 次に、セットアップは、"シーケンシャルファイルのナ…"ウィンドウは、そのまますべてを維持する、ポップアップ表示されます。 ベースの名前：イメージ; 写真番号：1; 数値の幅：3; タイプとして保存：MetaMorph TIFF; 画像が既に存在する場合は – >自動的に上書きします。 "ディレクトリの選択…",これが原因となる"フォルダの参照"ウィンドウがポップアップする]をクリックします。ここでは、ムービーフレームを保存するフォルダを（または新しいフォルダを作成）]を選択します。 その後、正しいフォルダがするとき（例：C：\データ\新規フォルダ）の下部に表示される"セットアップシーケンシャルファイルのNa …"ウィンドウは、"OK"をクリックします。 は、Acquireウィンドウで： DiIMGBIN2ように左下隅にある設定を選択します。 "露出時間"：20msの、"ビニング"：1。 その後、特別タブの： "センサーモード"：FT; "Digitizer"：10MHzの（EMゲイン）; "ゲイン"：Gain3（3倍）; のExpose用にオープンします。クリアモード：：CLEAR PRE EXP、クリア数：2、トリガモード＆ライブトリガモード：ノーマル（TIMED）カメラのシャッター、："45 EMゲイン"を選択します。 "平均へのフレーム"：3。 "閉じる"をクリックします。 MetaMorph画像を設定した後、底部に2つの1 mmのガラスロッドを搭載した35 mm培養皿でインサートを配置。 場所、さらにインサートを安定させるために挿入し、培養皿の壁の間に取り付けられたゴムチューブの三2ミリメートルの部分を。 加湿環境を維持するためにインサート内に追加の1mLの培地に浸した綿の約10 mm幅のピースを置きます。それが壁と同一平面との距離海馬スライスからであることを確認してください。 流体の損失を防ぐためにポリ塩化ビニルフィルムでしっかりと培養皿の上をカバーしています。 画像のフォーカスがCA3錐体細胞層であることを確認してください。 5倍、10倍、および20xでの位相の写真を撮ることによって、スライスの向きに注意してください。 画面に表示される"フォーカスを検索"ウィンドウで、設定範囲は、現在の+ / – （一番下の両方のボックスにチェックがついている）"1"と、ミクロン（s）で、"8"である、と精度に。 合焦画像を確保するために"フォーカスを検索"をクリックします。 "タイムラプスを取得"ウィンドウで、時間間隔を"1分"になる、と"6時間"（これらは私達の好まれた買収のパラメータである）になる期間を選択します。 正確にミクログリアの動きをキャプチャするには、イメージングは​​、一分間隔よりも頻繁にはないはずです。 画像保管場所では、スタックを選択します。 更新イメージウィンドウボックスは、他の2つのボックスの下にチェックされるべきですが、。 "ラムダ"と"ILLUM"を選択してください。 "OK"をクリックします。 映画は、今に開始されます。これは、他には何が、ムービーは、次のタイミング取得ステップで停止するまでのEscキーを、クリックして、早期にムービーを停止するまで、ムービーが終了するまで、またはMetaMorphプログラム内で実行されないことを意味します。 映画の終わりには、（）上記のようにSYTOXスクリーニングすることにより細胞障害を確認してください。 3。低レベルサイトカインは11-15をシグナリングするためのRNA抽出我々は以前、低レベルのサイトカインを定量PCRとPCRアレイ技術を使用してスライス培養におけるシグナル伝達を検出するための詳細な手順を提示した。6,7 我々は著しくスライス培養におけるサイトカインmRNAの検出のための私達のアプローチの感度を改善し、ここにこれらの改良点を提示している。 改善点は、私たちの組織の収穫へのアプローチとRNAの分離、腫瘍壊死因子α（TNF -α）の変化、およびcDNA preamplficationのためのサンプルのプレスクリーニング、〜以前のテクニックよりも感度が6倍であり、例えば、のための検出を可能にするなどがありますスライス培養インターフェロン-γ（IFN -λ）検出のは初めて。15 PCRの準備。 スライス培養を収穫。 実験に続いて、スライス培養用インサートは、 後に2〜3 mLのRNAに浸漬されており、4℃で保存処理まで3日前までのC。 収穫する、ダイヤモンドナイフを使用して余分な（すなわち、適切な海馬に隣接する組織）の組織を除去し、0.5 mLの滅菌リン酸塩を含む個々のRNase / DNaseフリー1.5 mLの遠心チューブにスライスを持ち上げて細かい先端塗料を使用して、緩衝食塩水（PBS）ブラシ。 ステレオタイプのファッションでスピンのサンプル（10,000回転× 1分）すべてのスライスがその管の同じ側に付着するので。 500μLTRIZOLにPBS清と再懸濁しますサンプルを削除します。 ストアサンプルを-80 ° CまたはRNA抽出するまで氷上で維持する。 このキットを使用するよりも大きいRNAの収量（ 図4）にしたRNeasyマイクロキットの結果とRNA抽出usingTRIzol。 TRIZOL -融解し、5分間室温でインキュベートする。 固形組織が表示されなくなるまで、1mLでサンプルを策定し、ダウンで組織を解離することpippetorおよび/またはボルテックスをひっくり返した。 100μLRNaseフリー（RF）クロロホルムを追加し、混在させるチューブを2-3回転倒。 毎分のボルテックス、室温で3分間インキュベートする。 4℃で15分間、13,000 rpmで遠心する新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移す。インタフェースを乱さないように注意してください。 室温RF 70パーセント分子生物学グレードのエタノール（〜300μL）の等量を追加。 数回上下にピペッティングして穏やかに混合。 をRNeasyマイクロキットの方向ごとに、次の手順に進みます。 2mLの利用いただき内に配置したRNeasyミクロカラムにサンプルを適用するn個のチューブ。 フロースルー廃棄、15秒間、10,000 rpmで遠心する。 350μLのバッファーRW1をRNeasyカラムを洗浄してください。 フロースルー廃棄、15秒間、10,000 rpmで遠心する。 穏やかに混合、70μlのBuffer RDDに10μlのDNaseを1ストック溶液を追加。 直接メンブレンにDNase溶液80μLを適用し、20分間室温でインキュベートする。 350μLのバッファーRW1をRNeasyカラムを洗浄してください。 15秒間を10,000 rpmで遠心分離、フロースルーとチューブを捨てる。 RNeasyカラムに500μlのBuffer RPEを追加。 フロースルー廃棄、15秒間、10,000 rpmで遠心する。 RNeasyカラムに500μLRF 80パーセント分子生物学グレードのエタノールを加えます。 2分間10,000 rpmで遠心する、フロースルーとチューブを捨てる。 オープンキャップを使用して、新しいチューブにRNeasyカラムを置きます。 5分間、フルスピード（すなわち、14,000 rpm）で遠心する。 RFマイクロ遠心チューブにRNeasyカラムを移す。 直接メンブレンに14μLのRF水を適用します。 溶出させるために1分間10,000 rpmで遠心する。 ストアサンプルを-80 ° Cまたは次のステップに進みます。 RNAの定量。 RF 1Xトリス- EDTA（TE）バッファーでRiboGreen 1:200に希釈する。 RNA標準として使用される酵母のtRNAを準備する。 ワーキング株式を100μg/ mLの時-20 ° Cに格納されています 1μg/ mlの（990μLTE 10μL）に希釈します。 次のように規格を作成する：60 ng /μLの、60μLのtRNAと40μlのTEを追加するためには、100の場合はng /μLの、、100μLを加える80のng /μLの、80μLのtRNAと20μlのTEを追加して40 ng /μLの20 ng /μLの20μLのtRNAと80μLのTEを追加し、0のng /μLの100μLのTEを加えるために、40μLのtRNAと60μLのTEを加える。 サンプルを準備します。 99μLのTE + 1μLのサンプルを組み合わせる。 重複して各サンプルを実行します。 マルチチャンネルピペッターを使用して、ウェルあたり希釈RiboGreen 100μLを加える。 ミックスを上下にピペッティングし。 プレートリーダーで蛍光を測定します。 フルオレセイン（485 nm/535 nmの、0.1秒）プログラム。 Excelのスプレッドシートに結果をエクスポートする。 RNAの濃度を決定する。 グラフの吸収に対するRNAの濃度とExcelでベストフィット線形回帰直線を作成します。 ベストフィットラインに関連付けられている回帰式から、サンプルRNAの濃度を決定する。 RNAの品質を決定します。 リボソームRNAのバンドの整合性は、アガロースゲル（ 図4）を介して測定されます。 それは（= RNA1μgのが必要と私たちの収量が小さいれるから）得られた各RNAサンプルの一部を実行するために非現実的ですが、それは定期的に証拠として模範的なサンプルを変性アガロースゲルを実行するのはいいことです、そのメソッド、正常に終了したら、高品質なRNA（すなわち、劣化のない）が得られます。 1％アガロースゲルを（100mLの容積のための）準備をします。 AWAY RNaseで徹底的にトレイとゲル櫛を鋳造、電気泳動槽を清掃してください。 フラスコに超純アガロース1gを秤量。 [3 – （N -モルホリノ）プロパンスルホン酸]は、RNaseフリー水83 mLと10倍MOPS 10mlを加え（〜3分）アガロースまでのバッファと電子レンジが溶解され、溶液は透明です。 10 × MOPS緩衝液を作るために 83.7グラムのMOPS、13.6グラムの酢酸ナトリウム、および3.7グラムEDTAを組み合わせる。 RNaseフリー水800 mLを加え、溶解するために混ぜる。 pHを7.0に調整し、1リットルに埋める滅菌またはオートクレーブをフィルタリング。 室温で保存し、光から保護。 ゲルが55℃に冷却し、7 mLの37％ホルムアルデヒドを（このステップは、化学ドラフト内で行う必要があります）を追加することができます。 トレイをキャストにゲルを注入し、ゲルがフードで固化することができます。 RNAサンプルを準備します。 RNAサンプルバッファー（500μL、新鮮なように）。 50μL10 × MOPS、250μLホルムアミド、90μLの37％ホルムアルデヒド、108μLRF H 2 O 2μLのエチジウムブロマイド（ストック溶液10 mg / mL）を組み合わせる。 RNA 1-10μgのために、三倍に希釈するため、サンプルバッファーを使用して、そのボリュームを倍増追加。 95℃で変性°その後5分間、および5分間氷上で冷やします。 スピンBRieflyと（必要に応じてローディング色素を追加）のRNAラダーと一緒にウェルに完全なサンプルをロードする。 電気泳動 1 × MOPSバッファーでチャンバーを埋める。 マーカーまで、50から75ボルトで電気泳動は、ゲルの2/3rd長さ約移行している。 UVトランスイルミネーター上でゲルを可視化する。 シャープな18Sと28SリボソームRNA（rRNA）のバンドがあることを確認し、28Sのバンドは18Sのバンド（ 図4）の2倍強であること。 分解したRNAは、塗抹外観、ファジーなバンドを持って、または2:1の比率を使用しません。 一般的に我々はトータルRNAの品質を評価するための光学密度を使用してください。 光度計を経由しているかのように敏感ではない、UV分光光度計は、RNAの品質をチェックするの迅速かつ費用効率的な手段です。 光学密度（OD）1.5から2.0までの280分の260の比率を探します。 RNAは（TE緩衝液に対して水）再懸濁されているソリューションは、OD比に影響を及ぼすことになりますことを覚えておいてください。 PCRの活動。 プレPCRのセットアップ特異的プライマーを設計 NCBIのPrimerblast使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/を ： 標的遺伝子のRefSeqのアクセッション番号を入力してください。 70〜200 bpのPCR産物のサイズを指定します。 フォワードおよびリバースプライマーとの間未満5 °の差で、55から72 °のTm値を指定します。 ゲノムバックグラウンドを減らすために、"プライマーはエクソン – エクソンのジャンクショ​​ンにまたがる必要があります"を選択します。 プライマーは、追加のターゲットを認識しないようにするため、ラットのRefSeq RNAデータベースのための特異性のチェックを有効にします。 以下の基準に適合する結果から、プライマー対を選択してください。 18〜30塩基長。 あなたのテンプレート上に離れて2000塩基よりも小さい。 テンプレートへのプライマーの安定な結合を確実にするために40から60パーセントグアニン – シトシン含量。 リファレンス遺伝子を選択する。 ないすべての参照の遺伝子は、あなたの実験のセットアップに適したものとなる。新しいパラダイムが使用されるたびに、あなたの参照の安定性を検証する必要があります。一貫性のために、我々は、RT 2 ProfilerのPCRアレイには、4個のリファレンス遺伝子のいずれかを使用することにしました。 良いリファレンス遺伝子は、以下の基準を満たしている必要があります。 その発現レベルは、実験パラダイムによって変更されていません。 これは、標的遺伝子と同様のレベルで発現される。 適切な基準を選択するには： お使いのシステムの安定したリファレンス遺伝子の候補とを識別するために文献をレビュー。それは虚血の研究において安定であることが示されたため、例えば、我々はRpl13aをテストした。11,12 上述したようなデザインのプライマー（またはRTPrimerDBのようなデータベースに共通のリファレンス遺伝子のため、既に検証済みのプライマーを見つけるhttp://www.rtprimerdb.org/~~V ）。 標的遺伝子のプライマーと一緒にプライマーを最適化する（下記参照）。 候補者の参照がグループ内の分散に基づいて各遺伝子の安定性の値を計算し、最も発現と遺伝子（s）を選択Normfinder（http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm）のようなソフトウェアを使用して最も安定であるかを決定サンプル以上のバリエーション。例えば、Rpl13aはSD（ 図4）に最適なリファレンス遺伝子である。 プライマーを最適化する。 定量PCRの一貫性と信頼性の高い結果を得るために、プライマーは、再現性、感度、及び特異性の特定の条件を満たす必要があります。 それぞれの新しいプライマーペアに対して、これらのパラメータをテストするのが最善です。 再現性は、複製技術的実行することで判定される。 感度は、連続する4倍希釈の標準曲線とパフォーマンスによって評価することができる。 特異性は融解曲線の解析とゲル電気泳動（ 図5）で単一の製品を確認することにより決定されます。 プライマーの品質をテストするために定量PCRプレート、および使用するプライマーの濃度を実行します。 1、1:4、1:16、1:64、1:256、およびテンプレートなしのコントロール（NTC）：全脳RNAから合成したcDNAを使用して、次のように標準曲線を（連続した4倍希釈系列）を作成。 各希釈液の場合は、duplicaのcDNA 1μLを実行するプライマーの各濃度、（すなわち、100nMの、200nMの、300nm）でのTE。 技術的に一貫性のCt値を与える複製されることを確認します。 希釈曲線のCt値を調べます。 希釈のそれぞれの濃度に対してCt値をプロットします。結果グラフは、良好な相関係数（すなわち、> 0.95）との線形でなければなりません。 単一の増幅産物（すなわち、単一ピーク）の存在を確認するために曲線を溶かす調べます。 そこに複数のピークがある、またはピークが類似していない場合、これは汚れ、ミスプライミング、プライマーダイマーのアーティファクトなど（ 図5）を提案するかもしれない。 NTCのピークはおそらくcDNAテンプレートがない場合に、より容易に形成するプライマーダイマーに対応し、考慮する必要はありません。 1％アガロースゲルで増幅産物を解決することによって溶融曲線のデータを確認してください。 1％アガロースゲルを（100mLの容積のための）準備フラスコにアガロース1gを秤量。 アガロースが溶解し、溶液が透明になるまで1 × Tris -酢酸EDTA（TAE）バッファーと電子レンジを100 mLを加え。 1 L 50 × TAEバッファーには、2 Mトリス塩基、57 mLの氷酢酸、及び0.05 M EDTA（pH8.0）で構成されています。 蒸留水（40 mMトリス – 酢酸、1.0 mM EDTAを最終濃度）で1倍にTAE緩衝液を希釈する。 ゲルは0.5μg/ mLの濃度にエチジウムブロマイドを追加する前に55℃に冷却することができます。 トレイをキャストにゲルを注入し、室温で固化することができます。 実行するには、1 × TAEで満​​たされた電気泳動槽にゲルを置く、、6Xローディング色素の2μLと定量PCRプレートからサンプル10μLを組み合わせてよく混ぜると分子量のラダーと一緒にウェルにロードします。 マーカーは、cDNA産物の予想されるサイズに応じて、適切な距離を移行するまで50〜150ボルトで電気泳動させる。 UVトランスイルミネーターで可視化する。 増幅されたPCR産物はターゲットに対して適切なサイズであることを確認してください。 プライマーダイマーが50 bpとなります。 増加したTNF -αでの事前画面。 TNF -αは、末梢における炎症反応を開始するため、私たちは、これが脳にも真であると進む前に、スライス培養免疫状態（すなわち、通常の、偽、と実験群）のマーカーとしてのTNF -αのmRNAの初期スクリーニングを使用して疑う完全なPCRアレイ解析に。 正常と偽制御TNF -αのmRNAレベルは我々の研究室、実験（すなわち、通常の、偽、および実験群）に見られる分析法間の範囲内にない場合、破棄され、完全なPCRのアレイ解析に進まないでください。 iScript cDNA合成。 20μLの最終容量に4μL5倍の反応ミックス、1μL逆転写酵素、25 ngのRNA、およびRF H ​​2 O：各RNAサンプルの場合は、PCRチューブに以下を組み合わせる。 ピペッティングにより穏やかに混合し、手短にスピンダウン。 インキュベート：25℃、5分、42℃、30分、85 ° C、5分。 1:4（60μLRNaseフリーの水を加える）に希釈する。 -20℃で保存または時間以内に使用する準備ができるまでは氷上に置きます。 TNF -αの定量PCR。 各プライマー対のマスターミックスを調製する。 12.5μLiQのSYBRグリーン、サンプルあたり1μLプライマーミックスおよび10.5μLの水を組み合わせる。 私たちのRpl13aとTNF -αプライマーの両方に、200 nMのは最適な濃度である。 1.5 mLのRFのマイクロ遠心チューブにプライマーおよび必要に応じて無駄のボリュームの量を調整して、プレートを設定しながら氷上に置きます。 コントロール/シャム/ experimentalsと定量PCRプレートを設定します。それぞれの遺伝子が重複してcDNAのあたりのサンプルの1μLを使用してください。 各ウェルに、マスターミックス24μLを追加し、混合するために上下にピペッティング。 彼らは蛍光測定値に干渉するので、泡を避けるために非常に注意してください。 PCR増幅の40サイクルを実行します。 95℃、8.5min。 40サイクル：95℃、10秒、60℃、30秒、72℃、20秒/サイクル。 それぞれが55で始まる10秒間0.5℃刻みの80サイクル℃、55℃、1分：曲線を溶かすデータ（。ΔΔCT法、図4）を分析する。13 PCRアレイ用のcDNA合成。 RNA 250 ngを持つように各サンプルの体積を（μL）を計算します。 あなたが一貫してあなたのサンプルから抽出できるRNA量（1μgの〜100 ng）を選択します。 RT 2最初ストランドキット-メーカーの指示に従って。簡潔に： すべての試薬を融解し、スピンダウン。 各RNAサンプルの場合は、PCRチューブに次のように組み合わせる。 RNA 250 ngの、最終容積10μlに5倍のゲノムDNA（gDNAを）排除のバッファーと水2μL。 ピペッティングにより穏やかに混合し、手短にスピンダウン。 42℃5分間インキュベートする。 1分間氷上で冷やします。 平均時間では、逆転写（RT）カクテル（毎サンプル）を準備します。 5倍RTバッファ3の4μL、1μLプライマーおよび外部制御ミックス、1μLのRT酵素ミックス3、水3μLを組み合わせる。 各サンプルにRTカクテルの10μLを加え、穏やかに混ぜる。 42℃15分間インキュベートする。 5分間95℃でインキュベートすることにより反応を停止します。 各20μLのcDNA合成反応（111μLの最終容量に希釈）にRF H ​​2 Oの91μLを加える。 ピペッティングでよく混ぜる。 -20℃で保存または時間以内に使用する準備ができるまでは氷上に置きます。 RT 2 ProfilerのPCRアレイ。 次の手順は、メーカーのものに従い、便宜上ここに改めて表明されています。 試薬を準備するすべての試薬を融解し、スピンダウン。 実験的なカクテルを準備します。 2倍SABiosciences RT 2定量PCR SYBR Greenマスターミックス、2700μLの最終容量にRF H ​​2 Oの希釈cDNAおよび1248μLを102μLの1350μLを組み合わせる。 慎重に密封された袋からPCRアレイを削除します。 ローディングリザーバーにカクテルを分注する。 マルチチャンネルピペッターを用い、各ウェルに25μLを追加。 慎重にシールPCRアレイプレート。 室温で1分間10,000 rpmでプレートを遠心する。 PCRのプログラムまで、氷上には準備ができています。 あなたのマシンのための適切なサイクリングプログラムを実行します。 iCycler： 95 ° C、10分 40サイクル：95℃、15秒、60℃、1分。 曲線を溶かす：55℃、1分、10秒ごとに55から始まる℃で0.5℃刻みの80サイクルデータを分析する。 ベースラインのサイクルのために"自動計算"を選択します。 手動でのしきい値を設定するには、しきい値の位置については、"ユーザー定義"を選択します。 "ログビュー"で、増幅プロットの線形位相の下三分の一のしきい値を設定します。 実行の結果のしきい値を同じままにしてください。 データをエクスポートします。 Excelファイルに入力。 SABiosciences PCRアレイのデータ解析にアップロードします。 http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php リファレンス遺伝子を選択してください – 私たちはRpl13aを使用していました。 私たちの実践は、以下のとおりです。 少なくとも重複PCRアレイとの結果を確認してください。 3倍の配列の変更は、その後の特定のターゲットのPCR増幅によって確認される必要はない。6,7 未満の3倍の変化は2-3 PCRアレイ（2倍の変化を確認するための、その後の特定のターゲットのPCR増幅または使用によって確認されるべきである。 DNAプレ増幅が期待される超低発現（ 図6）との目標を分析するために使用されます。 SABiosciencesのRT 2ナノPreAmpのcDNA合成キットとプライマーミックスは完全なPCRアレイを実行するために、サンプルRNAの少量の使用（1〜100 ng）を可能にするためにRNAのプレ増幅を目的としています。 各プライマーミックスは、最小限のバイアスで89遺伝子特異的cDNAターゲットテンプレートの増幅が可能になります。我々はそのような検出可能レベルにIFN -λのような低レベルの信号を増幅する手段としてこの制度を利用しています。 RT 2ナノPreAmpのcDNA合成キット-メーカーの指示に従って。簡潔に： すべての試薬を融解し、スピンダウン。 各RNAサンプルの場合は、PCRチューブに以下のように組み合わせる。 RNAの1 – 100ng、最終容積10μlに5倍のゲノムDNA除去バッファーと水2μL。 ピペッティングにより穏やかに混合し、手短にスピンダウン。 42℃5分間インキュベートする。 1分間氷上で冷やします。 </l私> それまでは、（サンプルあたり）RTのカクテルをご用意。 5倍RTバッファ3の4μL、1μLプライマーおよび外部制御ミックス、1μLのcDNAの酵素合成ミックス、1μLのRNase阻害剤、および水の3μLを組み合わせる。 各サンプルにRTカクテルの10μLを加え、穏やかに混ぜる。 42℃15分間インキュベートする。 5分間95℃でインキュベートすることにより反応を停止します。 -20℃で保存または使用する準備ができるまでは氷上に置きます。 特異的なプライマーでcDNAを増幅。 PCRチューブに次のように混ぜる。 12.5μLのPCRマスターミックス、7.5μL、特異的プライマー、および未希釈のcDNAの5μL。 PCR増幅の12サイクルを実行します。 95 ° C、10分。 12サイクル：95℃、15秒、60℃、2分。 4℃保持℃、 各サンプルを2μL副反応の減速を追加。 37℃で15分間インキュベートする。 5分間95℃でインキュベートすることにより反応を停止します。 各27μlのcDNAの増幅反応に84μLのRF水を加えます。 -20℃で保存または時間以内に使用する準備ができるまでは氷上に置きます。 SABプライマーと上記のようにSYBR Greenマスターミックスを使用して個々の遺伝子標的を増幅する。 4。サイトカイン制御の多重化リン酸化タンパク質アッセイ Mutliplexedリン酸化タンパク質アッセイは、サイトカインリガンド-受容体下流シグナル（ 図7）を定義するために使用されます。 スライス培養中の総タンパク質の量を決定する。 静かに1 mLの寒さの中に挿入し、位置のスライスを持ち上げて収穫のスライス培養（4 ° C）PBS。 30秒と削除PBSのためのチューブを遠心する。完成した収穫まで、ドライアイスの上に置きます。 -80℃で保存する総タンパク質のアッセイのためのスライス培養をホモジナイズする。 製造元の指示に従って、細胞溶解バッファーを準備します。 各スライス培養で溶解バッファーの少なくとも200μLを配置するために必要なバッファの総量にプロテアーゼ阻害剤を追加。 例えば：因子1、因子2、およびDMSOの500mMのPMSF 20μLの4.95 mLの細胞溶解バッファーに10μLの20μLを加える。 氷の上に200μLの溶解バッファーで切片培養を解凍。 氷の上ですぐに戻って1秒のパルスを所定の位置にスライス培養を5回超音波洗浄します。 10秒間ボルテックスするサンプル。 4で試料を遠心° Cを13,000 rpmで15分間。 きれいなチューブに上清を移し、氷上に置きます。 総タンパク質アッセイを実行します。 タンパク質の基準を準備。 アルブミン再構成する株式ウシ血清（BSA）は、製造元の指示に従って。 BCAタンパク質アッセイ用に高純度の水で希釈した0000〜1000μg/ mLのからまでの基準を準備する。 作業試薬の量は、サンプル数に基づいており、複製に必要な計算。 たとえば、次のように（8標準+ 18未知のサンプル）×（2はサンプルごとに複製）×（よくごとに必要な0.2 mLを作業試薬）マイクロプレートにロードされているすべてのサンプルに必要= 10.4 mLの合計量。 十分な音量を確保するために12mLの総量に切り上げます。 ときに機能して試薬用試薬Bとの混合試薬、いくつかの濁りが発生する可能性がありますが、すぐに消えるはずです。 サンプルとウェルあたり標準の10μLをロードする。 ウェルに働く試薬0.2mLをロードする。 シールテープでプレートをカバーし、30秒が混在して振る。 ℃で30分間37℃でインキュベートする。 595 nmの波長でのプレートリーダーで読み込む前に、室温まで冷却プレート（約10分）。 予想される濃度対測定した吸光度を使用してMicrosoft Excelを使用して標準曲線を構築する。 良好な相関係数が等しいか、または0.98よりも大きいです。 標準曲線から得られる線形方程式を用いてサンプル中のタンパク質濃度を計算する。 さらなる処理のための準備が整うまで-80℃でタンパク質や店舗を等量° Cへの溶解バッファーでサンプルを希釈する。 タンパク質濃度は200から900μg/ mLとから、製造元の指示に従っての範囲とする。 マルチプレックスアッセイを行う。 注：一晩incu続いてプレートの初期セットアップとロードの1時間で、リン酸化タンパク質アッセイが完了するのに合計2日間かかる多重化bationのステップと、追加のインキュベーションと洗浄の手順は、次の日。 井戸は手動でワークシートにしたがってライセートをどの含まれるているかをマップします。 室温で均質化した組織サンプルとキットの溶解液を融解し、氷上に置きます。 （ストレプトアビジンとビーズを除く）室温キットに付属しているすべてのバッファーと試薬をもたらす。 マルチプレックスアッセイのためのビーズを準備します。 光から保護するために、アルミホイルで結合ビーズを含むチューブをカバーする。 5秒と氷上に保つためのボルテックスチューブ。 結合したビーズを洗浄バッファーで1:50に希釈する。 各ウェルは、ウェル当たり50μLの合計量は49μLの洗浄緩衝液で結合したビーズの1μLを含める必要があります。 真空装置のキャリブレーションを行います。 ウェルあたり100μLの洗浄緩衝液でプレートを洗浄してください。 秒は2-5内の余分な液体から真空と吸引をオンにします。 バッファの完全除去が長いか2から5秒より短いかかる場合は、それに応じて圧力弁を調整する。 サンプルを追加する前に徹底的にプレートの底を乾燥させます。 5秒間ボルテックス希釈結合ビーズをし、指定されたウェルに50μLを加える。 すぐにフィルター掃除機、紙タオルでプレートの底を乾燥。 ウェルあたり100μLの洗浄バッファーで2回プレートを洗浄してください。各洗浄後にプレートの底を乾燥させます。 渦は3秒間のサンプルを解凍し、指定されたウェルに50μLを加える。場所は、光から保護されて、室温で300 rpmで振盪しながら15〜18時間、のためにプレートとインキュベートをテープで密封。 100μLの洗浄緩衝液で真空フィルタ余分な液体と洗濯板を三回。各洗浄後にプレートの底を乾燥させます。 洗浄緩衝液で検出抗体の1時25分を希釈する。 各ウェルに25μLの洗浄緩衝液の総体積で1μL、検出抗体を必要とします。 プレートにシールテープを置き、アルミ箔で光から保護する。徐々に1100回転する速度を上げ、30秒間振とうする。室温で30分間、300rpmで振盪し続ける。 真空は、プレートをフィルタリングし、100μLの洗浄バッファーで3回洗浄する。各洗浄後にプレートの底を乾燥させます。 光からプレートを保護しながら、ウェル当たり50μLを追加するのに十分なボリュームとストレプトアビジン- PEの1:100希釈を準備。光からソリューションを保護する。 徹底的にボルテックスし、ウェルあたり50μLの希釈したストレプトアビジン- PEを追加します。 30、1100 rpmで振盪しながらインキュベート秒、300 rpmで10分間続きます。 真空フィルタ過剰のバッファoff。 ウェルあたり100μL再懸濁用緩衝液でプレートを3回洗浄する。 各洗浄後は十分にプレートの底を乾燥させます。 各ウェルに125μL再懸濁バッファーを追加し、1100 rpmで30秒間振とうする。 すぐに24時間まで℃で光を避け4℃でプレートや店舗をお読みください。 5。模倣とサイトカイン制御の変調組換えサイトカインのタンパク質は、（キャリア付き）SDの変化を模倣するために使用されています。 凍結乾燥タンパク質（例えば、TNF -α）は、-20℃で最長1年間保存されています 3ヶ月以内の使用まで、0.1％ウシ血清アルブミン、アリコートでストック溶液に希釈した後、用意されて-20℃で保存。 スライス培養への操作は少なくとも3日ごとに更新されます。 サイトカインシグナル伝達がで止まります。 従来のサイトカインシグナル伝達カスケードの薬理学的薬剤の使用; 可溶性リガンドアンタゴニストの使用[例えば、可溶性TNF受容体1（組換え体リガンドのために上記のよう）]、または遺伝子サイレンシング[すなわち、低分子干渉RNA（siRNA）]。 神経細胞へのsiRNAのデリバリーは、しばしば問題になります。 共通の脂質ベースの試薬は、通常、低トランスフェクション効率と細胞生存率の損失につながる。 その代わりに、我々は、トランスフェクション試薬を使用せずに高効率のノックダウンを可能にするサーモサイエンティフィック社のDharmacon ACCELL siRNAを、使用してください。 ここでは、スライス培養におけるこのメソッドの使用の確認として、サイ​​クロフィリンB、あらゆる種類の細胞に発現し、非本質的なタンパク質のノックダウンを示しています。 配信プロトコルは、接着細胞で使用するためにメーカーの指示からスライス培養に適応されました。 RNaseを含まない水で1倍に5倍のsiRNAバッファーを希釈する。 1 ×バッファーで100μMのsiRNA溶液を準備するサイクロフィリンBのsiRNAは5 nmolのに提供されています。 100μMのストックの1 ×緩衝液50μlに再懸濁します。 ACCELL配信視野に入ってsiRNAを混ぜて1μMsiRNAの最終濃度にm。 6ウェルプレートのACCELLの配信媒体の1100μLに100μMの株式のsiRNAを11μLを加える。 インキュベーターの場所と温度は少なくとも20分間、通常の培養条件に平衡化することができます。 配信ミックスを含むウェルにBSL – 2フード及び無菌操作、転送のインサートを使用した。 タンパク質のノックダウンのための96時間配信のミックスでインキュベートする。 ウェスタンブロットによるタンパク質のノックダウンを評価したり、免疫を強化した。 ウェスタンブロットでは、ノックダウン効率のための潜在的な最初の選択しながら、SDの非有害な現象に関連する低レベルの免疫シグナリングのためにあまりにも区別されない場合があります。 したがって、我々は銀強化ジアミノベンジジン（DAB）免疫染色およびコンピュータベースのデンシトメトリー測定（下記参照）で負のウエスタンブロットの測定値に従っている。 6。プロテオミクスコンファメーションリン酸化タンパク質の変化の細胞の特異性は、免疫染色を用いて確立されます。6,7 で構成されるPLP固定液で24時間のスライス培養を固定させます。 10mLの16％パラホルムアルデヒド、1.096グラムリジン、0.42 gのリン酸ナトリウム、および0.17グラムの過ヨウ素酸ナトリウムは、超純水（固定剤が6.2 pHである）で80 mLの全量を埋め。 セクションへの準備ができるまで、24時間後、軽く細かいブラシとPBSを含むアジ化ナトリウム（100 mg / Lの）に転送してインサートからスライス培養を削除します。 その後、PBS – 20％ショ糖に少なくとも24時間のスライスをインキュベート、20μmのセクションに全体のスライス培養を切断し、ゲルコートスライドにマウントします。 蛍光免疫染色（例えば、NFκBのための）〜50 rpmで振盪に結合すべてのステップで次のように行われている。 10分間、3 mLのPBSで3回にスライス培養を洗浄してください。 ある場所のスライドは、すべての洗浄ステップのための〜40mLのPBSでコプリンジャーに20μmの切片培養をマウント。 PBSで3回、洗浄あたり10分でスライス培養を洗浄してください。 スライス培養でSFXシグナルエンハンサーの数滴を置き、30分間湿潤なチャンバー内でインキュベートする。 37℃で2時間スライス培養をインキュベートします0.75パーセントに希釈1:100でウサギ抗NFκβ抗体とCトリトンPBSでX – 100。 直接スライスにピペット抗体溶液。 抗体溶液からスライスを削除し、洗浄につき10分間PBSで3回洗浄する。 PBSのトリトンX – 100 0.75パーセントで1時50分でヤギ抗ウサギAlexaFluor 594抗体で1時間室温でスライスをインキュベートする。 溶液中で形成された可能性のあるすべての沈殿物を除去するために、10,000 rpmで15分間AlexaFluor 594抗体を遠心分離します。 PBS、洗浄あたり10分で3回洗浄する。 蒸留水に浸漬したスライドは、PBSからの塩を洗い流すために。 とカバーガラスは、退色防​​止剤培地を延長し、ライトから離れて覆われて、少なくとも2時間乾燥させる。 伝統的なや共焦点（ 図7）蛍光顕微鏡で視覚化する。 siRNAのノックダウンからのタンパク質産生の変化は敏感に銀の強化16とその後の濃度測定定量（例えば、サイクロフィリンBのためにここに示されている）（ビデオの図2）を介して7を免疫染色従来のDABを強化することにより評価することができる。 サイクロフィリンBのために免疫染色を使用して我々は最近詳細な明視野イメージングのための標準手順7に従っています 。 24時間抗マウスサイクロフィリンB（1:100）で4 ° C; 西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体標識（1:100）が続きます。 とDABの可視化。 DAB反応はデジタルデンシquantification17を許可するようにあまりにもかすかなfを、彼らは、クインとGraybielに応じて差別化された銀の手続きを強化することができます。16 スライドを再水和して、徹底的に高純度の水で10分間× 3を洗う。 コプリンジャーと56℃まで暖かいの高純度の水の代わりにスライドアンモニア性硝酸銀溶液（0.5％）を準備します。 株式の塩化アンモニウム（25-30％）は新鮮な高純度の水で（1:1）希釈する。 水酸化アンモニウム（100 mL当たり〜500〜600μL）簡単に曇りとして明確にオンになります0.5％硝酸銀溶液に撹拌しながら滴ずつを追加。 56に解決策を温める℃に 10月12日分のためのセクションをインキュベートする。 高純度の水で15秒（これとそれ以降のすべてのステップがコプリンジャーを用いて室温で行われる）のためのスライドを洗う。 ディップ1％チオ硫酸ナトリウム（五水和物）で15秒のためのスライド。 ディップは、高純度の水で15秒間スライド。 トーン0.2％塩化金で2分間スライドを。 15秒のために高純度の水にスライドを浸し。 2分では0.5％シュウ酸へのスライドを公開します。 高純度の水で15秒のスライドをつけます。 5％チオ硫酸ナトリウムで5分間スライドを扱います。 洗浄は高純度の水、脱水やカバースリップで徹底的にスライドします。 スライドは今デンシ定量化のための準備が整いました。17 明視野照明を含むすべての装置は、イメージングの前に少なくとも20分間オ​​ンになっています。 全体のスライス培養切片を倒立顕微鏡で5〜10倍で撮像される。 光強度が均一なレベル（例えば、〜2.6 V）に設定すると、すべての画像の取得によって変更されません。 NDフィルターは、"0"は完全な黒になり、4095は完全に白である12ビットのスケール（0〜4095）の〜1500に光量を伝送フル画像を縮小するために必要に応じて使用されています。 デジタル画像は、買収とスライス培養のセクションなしでスライドの領域を形成する派生背景画像も含め、すべての（すなわち、偽制御および実験試料）に対して電子的に保存されています。 背景画像は、すべての画像（偽と実験）と各スライス培養および登録透過光強度の周りに描画される関心領域（AOI）から減算されます。 画像強度の範囲は、すべての実験のために一定の範囲に設定されています。 明確にするために、結果は、制御レベル（ 図8）と比較して相対密度として表現。 7。代表的な結果： 図1。スライス培養電気生理学的記録のパラダイム。録画微小電極は、最初のCA3錐体ニューロンの層に配置され、その後双極刺激電極は、歯状回（DG）に配置されます。 図2。 CA3は、フィールドの誘発電位とシナプスうつ病の拡散誘導。 （A）実験は、標準のCA3領域の電場電位応答して、最大値の半分の強度がCA3領域誘発電場電位を誘発するために使用されているを最大化するために必要な電流の測定から始まります。これは、準備の間に誘発シナプス応答の正常について説明します。スライスのフィールド興奮性後シナプス電位は少なくとも3 mVのではない場合、スライスは破棄されます。拡散うつ病の引き金と（B）次に、トランスシナプス誘発しきい値は同じ時刻フィールドの電位でいる間（左（右、遅い応答）が決定され、高速応答）の準備が10Hzの刺激（例えば、高速の潜在的な記録の垂直偏差の振幅が類似している）に従うために十分に健康であることを文書化するために使用されます。 図3。低下シナプス活性に関連付けられているミクログリアの運動。証拠がミクログリア枝が拡張して、増加シナプス活動に格納されることを示していますが、シナプス活動に応答して、これらの細胞の長距離移動は、無傷の脳に記載されていません。これらの細胞の割合は、通常の条件下で長い距離を移動するミクログリアの蛍光イソレクチンB4ラベルを使用して我々の結果は、show。その下の画像に示すように、シナプス活性がテトロドトキシンに文化の曝露によって廃止されるとさらに、これらの旅行ミクログリアの数が大幅に増加しています。赤い線のマークのパスは、いくつかの典型的なミクログリアの起源をマーキング青い矢印が付いている6時間の期間にわたってミクログリアで旅。キャリブレーションバーは50μm。 図4。 PCRスクリーニング活動。 （A）我々は、我々の手で、以来、RNAの単離のためにキアゲンのキットと一緒に有意に大きかった（P <0.001、t検定）でこの結果TRIZOLを使用してください。単独でキアゲンのキットを使用するより海馬スライス培養物からRNAの収量を（B）でさらに、我々は定期的にシャープなRNAのバンドを示すゲルを介して決定されるように私たちのRNAの抽出手順は、高品質なRNAを生成することを確認してください。（C）我々は最高の安定性の値とリファレンス遺伝子を選択するNormFinderソフトウェアを使用する。例えば、スライス培養では、露出lipopolyssacharide（2時間では100 ng / mL）は、3つのリファレンス遺伝子（Rpl13a、β-アクチン、18歳）について分析した。 Ct値は、安定性の値を計算するために使用されています。ここに私たちのデータ[とその拡散うつ病（データは示さず）を使用して、他の実験のための] Rpl13aが最適なリファレンス遺伝子であることを示して。 （D）私たちは、実験群と偽のコントロール間の倍変化RNAの違いを検出する高感度で再現性の手段として"ΔΔCT"メソッドを使用します。 図5。 PCRの反応をチェックします。 （A）我々は、PCR反応の品質を検証する方法としてプライマー用希釈曲線の増幅を測定します。例えば、最適な増幅はCtのしきい値の均一（1-5）の増加を示しています。（B）とは対照的に、増幅が悪いプライマー（1-5）で一様ではない。（C）に加えて、我々がで融解曲線を行う（複数のピークの曲線として表示される）はDNAとmisannealed PCR産物を汚染する、プライマーダイマーを含むすべての二本鎖DNAが存在しないことを示して、目的のアンプリコンが検出されていることを確認するために、PCRアッセイ（すなわち、単一ピークの曲線）、の結論。 図6。ナノプレ増幅は、海馬スライス培養におけるIFN -λの検出を可能にする。のみ〜50 T -細胞ため、スライス培養（外〜55,000-90,000全細胞の）で発見され、我々としてRT 2ナノPreAmpのcDNA合成キットを使用するIFN -λの潜在的な超低レベル​​の発現を検出することを意味します。 cDNAのプリアンプのこの手段は、レベルをRNAに感度が12倍の増加を提供する。上に示された結果は、検出感度を高めるためにプリアンプの容量を示しています。リファレンス遺伝子Rpl13a用CTのしきい値は初期の増幅で20.5であり、これはプリアンプのキット、cDNAのPCR増幅の12サイクルに相当する12倍の増加を利用して14.1に増加した。並行して、IFN -λは検出されなかった（0.0）がプリアンプで、検出範囲（29.0）の範囲内であった。 図7。生得的なサイトカイン経路のリン酸化タンパク質リン酸化の変化。 （A）生得的なサイトカイン経路のリン酸化タンパク質のリン酸化に対するTNF -αの前処理（すなわち、神経保護）海馬スライス培養における興奮毒性損傷後24時間の例示的な効果を。 N -メチル- D -アスパラギン酸（NMDA）への曝露は、として表されるNMDA単独で（すなわち、実験的な対偽）にさらされるものと比較する前に結果は100 ng / mLのTNF -αとの3日間前処理したスライス間のCA1領域の変化を示すパーセンテージ。 TNF -αは、JNKおよびATF – 2の持続的なリン酸化の増加だけでなく、NFκBの一過性増加を誘導することに注意してください。（B）NFκBの活性化（すなわち、核内でリン酸化NFκBの存在）の空間分布が（免疫染色によって明らかにされる赤）。 [アストロサイトの例、（矢頭）]スライス培養のセクションでヨーヨーの染色核の緑。そうでない場合も緑色表示される錐体ニューロンは、、のためリン酸化NFκB（赤）でマーキング併用する代わりに、黄色です。キャリブレーションバーは25μm。 図8。 3日間200、500の適用後にグローバル海馬スライスサイクロフィリンBの発現を減少させる、siRNAの効率のプロテオーム確認は、サイクロフィリンBのためのペルオキシダーゼ-ジアミノベンジジンベースの免疫染色の差別化銀の激化は、そのsiRNAが有意に（ANOVA -ホルム-シダック方法P <0.001）ことができる示しています。 、または1,000 nMのsiRNAを。