使用扩频萧条的情节和慢性偏头痛的神经免疫信号建模<em在体外</em

几点值得强调在大脑切片的研究成功为免疫相关的SD信号。首先，启动刺激必须同步去极化足量的灰质脑发起的SD。这意味着一个接口配置（即流体接触，不仅低于上述切片文化插入气体交换）是必需的。1,2二，急性脑切片维持SD而是从自己编写的创伤，以及使用95％氧气加气林格氏液产生促炎性改变和癫痫的行为分别为，它可以改变神经电路功能和免疫动态平衡。3三，而海马切片文化克服这些急性切片的局限性，它是重要的，切片的文化应该是足够的时期保持前使用（即， 在体外大于10天），使小胶质细胞和星形胶质细胞成为静态的。3-5最后，SD应诱导使用无菌及无菌技术。下文概述的技术是设计来满足这一需要。 1。切片文化传播抑郁症文化的编制和维护。 切片文化准备和维护中马血清培养基或无血清培养基（SFM），6,7如前所述中期稍作修改8。孵化参数为36℃，5％的CO 2，95％的湿度平衡空气。 我们发现，文化可以切换到可持续森林管理后18天体外 ，我们先前定义的可持续森林管理的使用，其中包括额外的钙和镁的维持至少 35天的体外。 此外，抗生素和一个antifungicide添加多个记录集，以防止传染病的污染。 这一长期（或录音）培养基配方，含有（每100毫升）：Neurobosal中等，97毫升; GEM – 21，2.0毫升; Glutamax（200毫米），0.5毫升，庆大霉素（10毫克/毫升），10μL; D -葡萄糖（45％），680μL;抗坏血酸（0.5米），100μL; Fungizone（250毫克/毫升），400μL;氯化钠（5.0米），820μL，镁2 CL 2（1.0米） 80微升; 氯化钙 （1.0米），160-240μL。 文化是用于SD 在体外从21-35天。 3,6,7活力核查。 文化是筛选使用前锥体神经元死亡的证据。 在18天的体外 ，插入孵育20分钟的培养基中含有5微米Sytox绿色，当它结合到DNA（即渗透到死细胞），成为荧光标记（正常培养条件下） 。 插入，然后转回到他们以前的媒介，与CA3区，CA1区锥体神经元层损伤的证据（504激发和523排放）的荧光显微镜检查。 与20多个细胞或荧光超过250 IU的规范化水平切片排除进一步使用。 材料制造。 接地电极与玻璃试管（2.0 mm外径/ 1.16 mm内径）下调至4.5毫米的长度，并简要消防两端打磨。 我们使约20电极的时间，这可以持续一年多。 将100毫升1M氯化钾煮沸，添加搅拌3.5克，琼脂和0.5 g EDTA（乙二胺四乙酸二钠二水），产生一个清晰的黄色溶液。 使用安装在每个玻璃管吸引到温暖氯化钾/琼脂溶液的玻璃管，以及短距离成软管的软管长度短。 推出的吸力和允许氯化钾/琼脂缓慢滴注玻璃管开放提示;然后按住对开放玻璃管尖端一块冰。 后者演习将提示琼脂凝胶电极尖端，而不是凝胶后后退成玻璃管。 一旦琼脂凝胶在寒冷的自来水，软管可以删除没有改变定位在玻璃管的琼脂。 将0.5毫升的1 M氯化钾到每孔1.5 mL离心管架。然后放置一个提示每个氯化钾/琼脂充满单井玻璃管。 接下来，持有15号银线长度80厘米，用止血钳通过金刚砂板刮线举行的柜台上方的四面干净。 切成4厘米长度的导线，并放置到20-30分钟漂白充满坚定的Ag – AgCl系统的大衣放置在清洁的银表面闪烁小瓶。 每根电线弯曲一半，充满无线玻璃管的一端插入的自由端日氯化钾/琼脂，留约4-6毫米暴露。 最后，大衣玻璃管柄，含银线和小的程度上与GOOP电线，耐水性和灵活的胶水，以防止干燥的氯化钾/琼脂。重复所有电极。让胶水干通宵。 电极保存在4 °在闪烁瓶C（5-6电极/瓶），其中包含〜5毫升1个M KCl和25毫克的EDTA，明显阻碍细菌生长。 记录电极是由1.5毫米直径的细丝（视频图1）（0.86 mm内径10厘米长）的硼硅玻璃管。 拉拉到一个尖精尖与短玻璃管微电极。 我们通常拉电极〜7.5厘米长，1厘米的锥形。这允许适当的定位和电极尖端的可视化。 电极被拉到同一个Narishige PE – 2拉马。 微电极提示破碎到2-4微米使用装有一个校准的光学测微计的复合显微镜下可视化。我们用一个标准的玻璃组织学幻灯片边缘（25 × 75 × 1毫米）连接到一个液压一维显微另一个三维机械手轻轻地打破了微电极提示举行。 首先，安装电极连接到显微镜幻灯片使用粘土。 幻灯片，然后放在显微镜幻灯片固定器是用来将玻璃边缘附近的微电极尖端下滑的连接到液压机械臂。 最后，微电极尖端轻轻按按它的液压驱动的显微镜幻灯片边缘。 刺激电极双绞线双极电极，因为： 他们允许记录诱发场电位，否则将会从单极刺激​​刺激神器遮蔽。 双极刺激电极，可以轻轻地应用于齿状回表面无损伤，不像锐利的尖双极电极。 最后，应用电流本地化横向（裸）电极用聚四氟乙烯绝缘电线的圆形表面。 刺激电极制作开始切割〜20厘米的铂铱的长度（125微米裸直径200微米涂层直径）和聚四氟乙烯涂层线。然后，弯曲在一半的长度，并配合成一个松散的平结有始有终，离开结〜2厘米的导线的两端。 安全放在桌子上的一个电动手钻夹头结。 按住，用止血钳线的另一端​​，暂时关闭的演练和关闭，直到该导线紧紧双绞线（即，每个切割面将是一个从其他的距离相等时削减没有解开的电线是在横向方向）。 下一步需要附加导致刺激电极刺激隔离器用于连接的电线，裸露的铂铱双绞线两端。 这是通过焊接的铂铱丝〜50厘米规格30线两端。 首先，磁带的铂铱双绞线一条长凳上和双绞线年底下降了一个水坑浓盐酸。 接下来，从每个使用线切割机线约1厘米的绝缘剥离。 广场上的导线相邻双绞线结束剥离的结束，并申请了一种细尖的烙铁的热量，然后焊料，直到两条线牢固地附着。 滑在裸露的电线连接一个热缩管的小长度和收缩配合热。 重复第二线。 消防波兰15厘米巴斯德吸管的提示和引导下来吸管，直到约6厘米的扭曲突出的扭曲的铂铱丝。 使用防水剂环氧树脂（例如，巴顿焊接），密封两端的电极。 最后，将刺激隔离器的连接导线两端的香蕉插头。 根据立体观测，将在PBS的电极尖端寻找电解产生气泡只切端电极提示。从双绞线的双方如果有任何气泡，减少电极使用一个新的单边沿刀片，以重新建立完整的绝缘线长轴横向削减。 当故障排除，以解决异常刺激的影响，尝试新鲜切割电极尖端。 作为录制菜组成虱子文化插入35毫米的培养皿中，坐在两个1.0 × 12毫米的玻璃间隔相距约1.0厘米棒。将玻璃棒菜基地，通过加热的玻璃试管，然后按与钳基地。 对于静态的录音条件下，添加1.5毫升培养基的菜。 接下来，在1.0毫升培养基浸泡一个〜10毫米，宽3-4厘米长的无菌棉片。折沿长轴的一半棉花和地方沿内以及用无菌镊子插入。湿棉花有助于保持菜的湿度。 三可压缩4毫米的管道长度等距插入各地。 盖菜，紧密地与聚氯乙烯薄膜，这使得气体交换。 围绕其中旬墙面垂直切割一条边的刀片，以除去多余的聚氯乙烯薄膜。 电生理设置切片文化插入大会放入电生理录音PDMI录音室。 PDMI室插入/培养皿大会涵盖了2毫米厚的塑料PDMI室提供的光盘，录音电极，介质的流入/流出管等需要定位的各种小孔我们定期监测与组合的一个缩影pH电极与温度T型热电偶探头装到一个密封的半电极，以确保7.3 pH值和36.0 ° C条件的一个缩影类型介质的pH值。 插入/商会是加气5％二氧化碳的平衡空气和媒介或者是静态或在流（1.2毫升/分钟）在35-36日举行的插入中心配置° C。 对于流量条件下，介质加热与内联加热器，再次录音室的中心保​​持在36 ° C。 一个蠕动泵泄压系统带来了成片文化的无泵的脉动介质。 PDMI室提供的吸引器是用来清除插入通过轻柔吸的媒介。 稳定，香港总商会是装在一个特别设计的伯利直布罗陀的倒置显微镜阶段，拥有一个倒置显微镜和坐在无振动表的。 小孔打开通过插入包装的聚氯乙烯，具有体积小，电池供电的烧灼工具。 接下来，如果要使用一个流动配置，入口和出口流量开始，接地电极的位置。否则，简单地把到位的接地电极。 放置电极，与micromanipulators地方举行，刚刚超过5倍的放大倍率（ 图1）倒置显微镜观察切片。 开始记录电极与刺激电极。 我们使用的音频监控微电极片接触时要注意。小费是在沿CA3区锥体细胞体层的中点位置。 录音开始，轻轻碰了一下，然后刺激电极齿状回的中点表面。 在这两种情况下，初始电极动作完成的粗控制，并最终定位只使用相衬照明与液压，精细的控制，使细胞体层可以很容易地分辨。 〜25微米直接镜检可视化下增量进展电极。 一旦电极接触的组织，提前20-30微米的另一个电极。 录音开始前刺激电极到位，一定不会触发SD（即，通过机械性刺激，）。 在实验开始前，允许经过大约10分钟。 Transynaptically诱导的SD。 如下（ 图2），优化诱发海马CA3领域的潜力。 CA3领域的潜力是诱发与100μs的脉冲（0.2赫兹）的电流，足以触发响应（例如，〜1-5μA）开始。 沿锥体神经元长轴的增量记录电极移动，直到领域的潜力是最大的。 然后，在这个位置上增加与记录电极的电流，并注意最大电流响应（例如，〜10-20μA）。 最后，为实验中使用的半极大的刺激强度（如深水控制的定期刺激）。 确定突触诱发SD（ 图2）的门槛。 随着电极配置概述上述诱发场电位，开关的刺激范式单一，人工诱发的阵阵10个脉冲（10赫兹100μS/脉冲），以前一个范例应用在整体动物研究。 逐步增加电流强度每刺激爆裂，直到SD触发。等待至少60-120秒之间刺激。 报告SD阈值在库伦（即，当前的X时间）。 在其他的实验，需要测量多个标准差感应，使用可能引起的SD刺激强度（例如，〜100-500 NC）。 触发的SD每一个小时9分钟。 一定要在整个实验中使用的无菌技术。 最后的SD后，返回文化插入到正常的孵化条件。 马克的培养皿中，要注意文化，经验丰富的SD。 我们的习惯是把一个单一的标记，左边和两个分片文化插入右侧，注意到＃1，＃2和＃3由左到右三种文化。 更改中期每3-4天收获，直到文化。 对于经常性的SD，按照上述程序。 我们通常会测试多个标准差的初始小时后在SD阈值1，3，7，和14天的变化。 CA3区快速的潜力和缓慢的潜在变化是通过单独的数字信号处理系统记录。 2。在海马脑片培养的模范生命影像切片文化，同样可以进行监控动态居民（即小胶质细胞）的免疫细胞的功能行为无细胞损伤或免疫激活（ 图 3） 9。 例如，标签的小胶质细胞，以评估其运动的SD突触活动的变化有关，我们用荧光标记的isolectin – IB 4 。 “外源凝集素PBS”是额外的阳离子PBS（0.1毫米每个氯化钙 ，氯化镁2，MnCl 2），因为需要二价阳离子（0.1-1.0毫米），小胶质细胞细胞膜上的α- D -半乳糖基团结合凝集素。 设为“凝集素PBS”的解决方案： 对于1升PBS，使用无菌技术操作和无菌过滤，地址： 100μL1M氯化镁2 100μL1M MnCl 2 100μL1M 氯化钙 调匀相结合，并保持冷藏于4 ° C。 每isolectin小瓶只有500μL“凝集素PBS”是需要的，但因为它可以冷藏，并保持在几个月时间，也可能是有用的，以弥补更大的卷。 重组AlexaFluor 594标签isolectin IB4（isolectin）冻干粉TO1 mg / ml的“凝集素PBS”。 为了最大限度地减少漂白，执行此步骤，尽快，尽量减少光线照射。 Isolectin可以一次分装到20μL在1mg/ml的重组，在-20 ° C保存长达一年。 稀释isolectin至20微克/毫升生长介质和成像前4-10小时正常孵化条件的孵化片文化。 成像设置。 成像设置包括：显微镜，快门，相机，轻，2.0中性密度滤光镜，36 ° C，气体：5％CO2，空气（或20％的氧，氮平衡）。 打开显微镜，照相机，紫外线，温度控制，气体至少一个小时前成像。 MetaMorph影像协议。 从“日报”下拉式菜单中，选择“运行日志…". 这应促使开放期刊的文件夹，你应该选择“运动的W – VAR AFS（杂志以前建立，遵循以下步骤）”，点击“打开”。 的“自动对焦频率”窗口会弹出下，保持在1号码，点击“OK”。 接下来，设置“顺序文件娜… …”窗口会弹出，保留一切是： 基地名称：图像; 图片数：1; 数宽度：3; 保存类型：MetaMorph TIFF; 如果图像已经存在 – >自动覆盖; 点击“选择目录…",这将导致弹出”浏览文件夹“窗口。在这里，选择动画帧应保存的文件夹（或创建一个新的文件夹）。 然后，正确的文件夹（如C：\ DATA \新建文件夹）时，显示在底部的“设置顺序文件NA … …”窗口中，单击“确定”。 在Acquire窗口： 选择设置在左下角是DiIMGBIN2; “曝光时间”：20MS“分级”：1。 然后，在特别标签： “传感器模式”：金融时报; “小指ZER“：10MHz的（EM增益）; “增益”：Gain3（3倍）; 选择“EM增益：45”;相机快门打开为公开;清除模式：清除预进出口;清除计数：2，触发模式和即时触发模式：正常（定时）。 帧，以“平均”：3。 点击“关闭”。 设立MetaMorph成像后，放置在一个35mm的培养皿中，用两个1毫米，在底部的玻璃棒插入。 广场进一步稳定插入橡皮管插入和培养皿壁之间装有三个2毫米件。 将〜10毫米宽的棉花一块浸泡里面插入一个额外的1毫升培养基中保持加湿环境。确保它是冲洗墙壁和距离海马。 用聚氯乙烯薄膜覆盖的培养皿中的顶级紧，以防止液体流失。 确保成像的焦点是CA3区锥体细胞层。需要注意的5倍，10倍和20倍的阶段图片切片的方向。 在“焦点访谈”的窗口出现在屏幕上，设置的范围内，目前的+ / – 以“8”，和精度，在微米（S），“1”（在底部的两个方块应检查） 。 点击“查找焦点访谈”，以确保在聚焦图像。 在“收购Timelapse”窗口，选择时间间隔为“1分钟”，持续时间为“6小时”（这是我们首选的采集参数）。 为了准确地捕捉小胶质细胞的运动，成像应不低于每分钟一次的频繁。 在图像存储，选择堆栈。 更新图像窗口中应检查，而不是其他两个箱子底下。 选择“ILLUM”，“拉姆达”。 点击“OK”。 现在，这部电影将开始运行。这将意味着，没有别的可在MetaMorph方案执行，直到影片结束，或直到您停止电影早期按一下Esc键，之后影片将停止在下次定时采集一步。 在电影的结尾，上述（一）所指出的Sytox筛选检查细胞损伤。 3。 RNA的提取低级别的细胞因子信号11-15 我们以前提出的6,7检测低层次的细胞因子信号采用定量PCR和PCR阵列技术在片文化的详细说明。 我们得到明显改善片培养的细胞因子mRNA检测方法的敏感性，目前这些改进。 这些改进包括我们组织收获和RNA分离方法，样品肿瘤坏死因子（TNF -α）的变化，和cDNA preamplfication预审，这是〜6倍，比以前的技术更敏感，，例如，允许检测首次切片文化γ-干扰素（IFN -λ）的检测。15 PCR技术准备。 切片文化收获。 被淹没在下面的实验，切片文化插入2-3毫升RNA 后 ，保存在4 ° C至3天，直到进一步的处理。 收获，删除多余的（即毗邻的海马适当的任何组织）组织使用钻石刀，并提升到单个核糖核酸酶/ DNA酶免费1.5 mL离心管含0.5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的片，用细尖油漆刷。 旋转样品在刻板的方式（10,000 RPM × 1分钟），使所有切片坚持他们管的同一侧。 PBS上清，重悬样品取出500μLTRIzol试剂。 商店的样品于-80 ° C或保留，直到RNA提取的冰。 RNA提取usingTRIzol的RNeasy在更大的RNA产量比单独使用的试剂盒（ 图 4）微套件结果。 解冻TRIZOL的样品在室温下孵育5分钟。 游离组织图纸样品用1 mL和放倒pippetor和/或震荡，直到坚实的组织不再可见。 加入100μLRNase的自由（RF）氯仿，颠倒管2-3次混合。 在室温下孵育3分钟，涡旋每分钟。 在15分钟13000转离心4 ° C。 上清转移到一个干净的1.5 ml离心管。小心不要打扰接口。 加入同等体积的室温射频分子生物学级70％乙醇（〜300μL）。 轻轻混匀移液器向上和向下几次。 ％的RNeasy微型试剂盒方向继续以下步骤： 申请样品放置在一个2ML collectio的RNeasy微型列n管。 以10,000 rpm离心15秒，弃流过。 洗350μL缓冲液RW1的RNeasy列。 以10,000 rpm离心15秒，弃流过。 新增10 UL脱氧核糖核酸酶1的股票的解决方案，以70μL缓冲的RDD，轻轻混匀。 申请直接到膜80μL的DNA酶溶液，在室温下孵育20分钟。 洗350μL缓冲液RW1的RNeasy列。 以10,000 rpm离心15秒，弃流和管。 加入500μl缓冲的RPE的RNeasy列。 以10,000 rpm离心15秒，弃流过。 添加500μL，RF 80％的分子生物学级乙醇的RNeasy列。 以10,000 rpm离心2分钟，弃流和管。 瓶盖打开，放置在新管的RNeasy列。 全速（即14000 RPM）离心5分钟。 的RNeasy列转移到RF的离心管。 14μL射频水直接膜。 以10,000 rpm离心1分钟洗脱。 商店样品于-80 ° C或继续下一个步骤。 RNA定量。 稀RiboGreen 1:200射频1X的Tris – EDTA（TE）的缓冲区。 准备使用的RNA标准的酵母tRNA。 工作股票是储存在-20 ° C〜100微克/毫升稀释到1微克/毫升（10μL，在990μLTE）。 创建标准如下：为100 ng /μL，加入100μL，80纳克/μL，加80μLtRNA和20μLTE，60纳克/μL，加60μLtRNA和40μLTE，40纳克/μL加入40μLtRNA和60μLTE，为20毫微克/μL加入20μLtRNA和80μLTE，0毫微克/μL加入100μL的TE。 制备样品： 结合99微升TE + 1μL样品。 每个样本重复运行。 使用多通道移液器，每孔加100μL稀释RiboGreen。 移液器上下搭配。 酶标仪上测量荧光。 荧光素（485 nm/535纳米，0.1秒）计划。 结果导出到Excel电子表格。 确定RNA的浓度。 图吸光度与RNA浓度，并创建一个最适合在Excel中的线性回归线。 确定最佳拟合线的回归方程的样本RNA浓度。 确定RNA的质量。 核糖体RNA带的完整性测量通过琼脂糖凝胶电泳（ 图4）。 虽然这是不切实际的，运行的每个RNA样品中获得的分数（因为= 1微克的RNA是必需的，我们的产量是小），它是一个好主意，定期上运行的一个模范样本变性琼脂糖凝胶作为证明，该方法时，处理得当，产量高品质的RNA（即没有退化）。 准备一个1％琼脂糖凝胶（100毫升卷）。 清洁电泳槽，铸造用RNase托盘和凝胶梳子彻底了 。 成一个烧瓶中称取1克的超纯水琼脂糖。 添加83毫升的RNase免费的水和10毫升10X MOPS [3 – （N -吗啉）丙磺酸]缓冲和微波直到琼脂糖溶解和解决方案是明确的（〜3分钟）。 为了使10X MOPS缓冲结合MOPS 83.7克，13.6克醋酸钠，和3.7克EDTA。 加入800毫升核糖核酸酶自由水，混合溶解。 调整pH至7.0，并填充至1 L。 过滤消毒或高压灭菌。 储存在室温，避光。 允许凝胶冷却至55 ° C和添加7毫升37％的甲醛（这一步应该在化学通风柜）。 倒入铸造托盘的凝胶，凝胶，并允许以巩固在引擎盖。 准备RNA样品。 RNA样品缓冲液（500μL，作出新的）。 结合50μL的10倍MOPS，250μL甲酰胺，90μL37％的甲醛，108μL，RF H 2 O和2μL溴化乙锭（原液10毫克/毫升）。 为1-10微克的RNA，加双其体积样品缓冲液，稀释三倍。 变性在95 ° C为5分钟，然后寒意冰5分钟。 自旋BRiefly和负载RNA的阶梯旁边一个完整的示例（加样染料，如果需要的话）成井。 Electrophorese 填写1X MOPS缓冲室。 Electrophorese在50-75伏，直到标记迁移约2/3rd的凝胶长度。 可视化在紫外透射凝胶。 验证有清晰的18S和28S核糖体RNA（rRNA的）频段，28S乐队是激烈的两倍，18S条带（ 图 4 ）。 降解的RNA将有一个涂外观，模糊带，或将不会出现2:1的比例。 通常情况下，我们使用光密度，以评估总RNA的质量。 虽然不敏感，通过Nanodrop紫外分光光度法是一种快速检测RNA的质量和成本的有效手段。 看光密度（OD）260/280 1.5-2.0比例。 请记住，在这种RNA是重悬（TE缓冲液与水）的解决方案会影响OD比率。 PCR检测活动。 前PCR设置设计特异性引物使用NCBI的Primerblast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ： 输入的RefSeq加入靶基因的数量。 指定70〜200 bp的PCR产物大小。 指定的55-72 ° TM，低于5 °之间的正向和反向引物差异。 选择“引必须跨越一个外显子 – 外显子交界处”，以减少基因背景。 启用大鼠的RefSeq RNA的数据库，以确保引物不承认其他目标的特异性检查。 从结果中选择一个引物对符合下列条件： 长18-30基地。 除了您的模板少于2000个碱基对。 鸟嘌呤 – 胞嘧啶含量40-60％，以确保稳定的引物结合到模板。 选择一个参照基因。 并不是每一个参照基因，将适合你的实验设立。每一个新的范式使用时，参考的稳定性应予以核实。为了保持一致性，我们选择使用RT 2探查PCR阵列所提供的四个参考基因之一。 一个很好的参考基因应符合下列条件： 不改变其表达水平的实验范式。 这是类似的靶基因的表达水平。 选择一个合适的参考： 回顾文献，以确定系统中的一个稳定的参考基因可能的候选人。例如，我们测试Rpl13a的，因为它被证明是稳定缺血的研究 。11,12 设计引物，上面所讨论的（或寻找在一个类似RTPrimerDB的数据库共同参考基因已经验证引物http://www.rtprimerdb.org/ ）。 优化目标基因的引物引物一起（见下文）。 确定候选人参考是最稳定的使用Normfinder（http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm）集团内部方差的基础上计算了每个基因的稳定性价值，并选择至少表达的基因（S）这样的软件以上样品的变化。例如，Rpl13a是SD（ 图4）的最佳参照基因。 优化引物。 为了从定量PCR获得一致和可靠的的结果，引物，以满足一定的标准重现性，灵敏度和特异性。 最好是每一个新的引物，以测试这些参数。 重复性测试运行技术复制。 感光度可以由一个连续的4倍稀释的标准曲线的性能进行评估。 特异性是由单一产品的熔解曲线分析和凝胶电泳（ 图5）确认。 运行的qPCR板测试引物的质量，并要使用的引物浓度。 使用全脑RNA合成cDNA，创建如下的标准曲线（连续4倍稀释系列）：1，1:4，1:16，1:64，1:256，并没有模板控制（NTC） 。 对于每个稀释度，运行1μL的cDNA在duplica特对每个引物浓度，（即100纳米，200纳米，300纳米）。 确认技术复制给一致的Ct值。 检查稀释曲线的Ct值。 暗算每个稀释浓度的Ct值。由此产生的图表应具有良好的相关系数（即> 0.95）的线性。 检查熔解曲线确认存在一个单一的扩增产物（即单峰）。 如果有多个峰，或不相似的山峰，这可能表明污染，错配，引物二聚体的神器，等（ 图5） 。 在NTC的高峰可能会对应在模板cDNA的情况下更容易形成引物二聚体，不应该引起人们的关注。 确认解决扩增产物在1％琼脂糖凝胶熔化曲线数据。 准备一个1％琼脂糖凝胶（100 mL体积） 成一个烧瓶中称取1克的琼脂糖。 加入100毫升1X的的Tris -醋酸EDTA（TAE）缓冲和微波直到琼脂糖溶解和解决方案是明确的。 1升50X TAE缓冲液由2 M Tris碱，57 mL冰醋酸，0.05 M EDTA（pH值8.0）。 TAE缓冲液稀释1倍，用蒸馏水（终浓度：40毫米的Tris -醋酸和1.0毫米EDTA）。 允许凝胶冷却至55℃前加入溴化乙锭的浓度为0.5微克/毫升。 倒入铸造托盘凝胶，并允许它在室温下固化。 要运行，放置在凝胶电泳室充满1X TAE，结合从2μL6X样染料的qPCR板10μL的样品，拌匀和成井负载一起分子量阶梯。 在50-150伏Electrophorese直到标记已移居适当的距离，您的cDNA产物预期大小而定。 可视化与紫外透射。 确认扩增的PCR产物为你的目标是适当的大小。 引物二聚体，将周围50个基点。 前屏幕增加肿瘤坏死因子-α。 由于TNF -α启动在外围的炎症反应，我们怀疑这也是真正的大脑和初步筛选，然后再继续使用肿瘤坏死因子-α片文化的免疫状态（即正常，假手术组，实验组）的标志基因完整的PCR阵列分析。 如果正常和深水控制肿瘤坏死因子-αmRNA水平是不是在我们的实验室，实验（即正常，假手术组，实验组）中发现了一个测定间范围内被丢弃，不进行全面的PCR阵列分析。 iScript cDNA的合成。 对于每个RNA样品，结合以下内容：在PCR管4μL5倍的反应混合物，1μL逆转录，25纳克RNA， 和 RF H ​​2 O至终体积20 μL。 混合轻轻吹打和简要降速。 孵育：25 ° C，5分钟; 42 ° C，30分; 85 ° C，5分钟。 稀1:4（加60μLRNase的自由水）。 储存在-20 ° C或在冰上，直到在几个小时内就可以使用。 为肿瘤坏死因子-α的qPCR。 准备为每个​​引物的主组合。 联合收割机12.5μL，1μL引物组合和每个样本的10.5μL水的iQ SYBR GREEN。 对于我们Rpl13a和TNF -α引物，200 nm的最佳浓度。 调整必要的引物和废品量量在1.5毫升射频的离心管，并保持在冰上，而你成立的板。 设置一个控制/沙姆斯/ experimentals的qPCR板。 1μL的cDNA每个样品每个基因重复使用。 每孔24μL到您的主结构和吸管向上和向下混合。 要非常小心，以避免泡沫，因为它们会干扰荧光读数。 运行40个循环的PCR扩增： 95℃，8.5min; 40个循环：95 ° C，10秒，60℃，30秒72 ° C，20秒/周期。 熔解曲线：55 ° C，1分钟80周期0.5 ° C，增量为10秒，在55 ° C。 分析数据（ΔΔCT方法;图4）13。 合成cDNA进行PCR阵列。 计算每个样品的体积（μL），有250纳克的RNA。 选择坚持，你可以从你的样品中提取的RNA（100毫微克至1微克）的金额。 RT 2第一链套件-按制造商的说明。简述： 解冻和自旋向下的所有试剂。 对于每个RNA样品，在PCR管相结合以下内容： 250 ng的RNA，2μL的5倍基因组DNA（基因组DNA）消除缓冲区和水到终体积10μL。 混合轻轻吹打和简要降速。 在42℃孵育5分钟。 冰浴1分钟。 在平均时间，准备的反转录（RT）鸡尾酒（每个样品）： 结合4μLRT缓冲3 5倍，1μL，引物和外部控制混合，1μL逆转录酶混合3，和3μL水。 每个样品中加入10μLRT鸡尾酒，轻轻混匀。 在42℃孵育15分钟。 孵化在95℃5分钟，停止反应。 添加91μLRF H 2 O各20μLcDNA合成反应（稀释到终体积为111μL）。 吹打混合。 储存在-20 ° C或在冰上，直到在几个小时内就可以使用。 RT 2探查PCR阵列。 下面的说明遵循制造商的，并重申为方便起见，这里。 准备试剂解冻和自旋向下的所有试剂。 准备实验鸡尾酒： 结合1350μL2X SABiosciences RT 2定量PCR SYBR GREEN的master mix，102μL稀释的cDNA和1248μLRF H 2 O到终体积为2700μL。 小心取出从密封袋中的PCR阵列。 免除到装载水库的鸡尾酒。 与多通道移液器，每孔加入25μL。 仔细密封PCR阵列板。 在室温下1分钟10000转的离心机板。 直到冰PCR程序已准备就绪。 为您的机器上运行适当的循环程序。 iCycler： 95℃，10分钟 40个循环：95 ° C，15秒60 ° C，1分钟。 熔解曲线：55 ° C，1分钟80周期为10秒每一个在55 ° C 0.5 ° C增量分析数据。 选择“自动计算”为基准周期。 选择“用户定义”手动设置阈值的阈值位置。 在“日志查看”，设置在扩增曲线的线性相位低三分之一的门槛。 一定要保持整个运行相同的阈值。 导出数据。 输入到一个Excel文件。 上传SABiosciences PCR阵列的数据分析。 http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php 选择参考基因 – 我们使用Rpl13a。 我们的做法是： 确认至少有一个重复的PCR阵列的结果。 3倍的阵列需要修改，不能由后续的具体目标PCR 扩增证实。6,7 随后的具体目标PCR扩增或使用2-3 PCR检测阵列（减超过3倍的变化，应确认，确认2倍的变化。 DNA扩增前用于分析与预期的超低表达（ 图6）目标。 SABiosciences的RT 2纳米PREAMP的cDNA合成试剂和引物组合用于预扩增的RNA，允许使用少量的样品RNA（1-100纳克），运行一个完整的PCR阵列。 每个引物组合可扩增为89个特定基因的cDNA以最小的偏见目标模板。我们使用这个系统，如干扰素-λ低的水平信号放大到探测水平的一种手段。 RT 2纳米PREAMP cDNA合成试剂盒-按制造商的说明。简述： 解冻和自旋向下的所有试剂。 对于每个RNA样品，在PCR管相结合以下。 1 – 100ng RNA的5倍基因组DNA消除缓冲区和水到终体积10μL，2μL。 混合轻轻吹打和简要降速。 在42℃孵育5分钟。 冰浴1分钟。 </l我> 在此期间，准备在RT鸡尾酒（每个样品）。 结合4μL5倍RT缓冲3，1μL，引物和外部控制混合，1μL的cDNA酶的合成结构，1μLRNase抑制剂，与3μL水。 每个样品中加入10μLRT鸡尾酒，轻轻混匀。 在42℃孵育15分钟。 孵化在95℃5分钟，停止反应。 储存在-20 ° C或冰面上，直到准备使用。 cDNA扩增特异引物。 在PCR管中混合以下内容： 12.5μL的PCR扩增预混，7.5μL的特异性引物，和5μL未稀释的cDNA。 运行12个循环的PCR扩增。 95℃，10分钟。 12个循环：95 ° C，15秒60 ° C，2分钟。 保持在4 ° C。 每个样品中加入2μL侧面反应减速。 在37 ° C下15分钟。 孵化在95℃5分钟，停止反应。 加入84μL的射频水每27μLcDNA扩增反应。 储存在-20 ° C或在冰上，直到在几个小时内就可以使用。 放大个人的基因目标，使用SAB的引物和SYBR Green预混如上所述。 4。细胞因子信号复用的磷蛋白分析 Mutliplexed磷测定是用来定义因子配体-受体下游信号（ 图7）。 确定的总蛋白量切片文化。 轻轻提起片插入和地方在1毫升冷丰收片文化（4℃），PBS。 为30秒和删除PBS离心管。干冰地点，直到完成收割。 储存在-80 ° C。 总蛋白测定均质片文化。 根据制造商的指示，准备细胞裂解液。 添加蛋白酶抑制剂的缓冲总量需要至少200μL裂解液放在每个切片文化。 例如：添加20μL因子1，因子2，和20μL二甲基亚砜500毫米PMSF至4.95 mL细胞裂解液10μL。 在200μL裂解液在冰上解冻片文化。 超声片文化在1秒脉冲五倍，并立即回到冰的地方。 涡样品为10秒。 离心样品在4 ° C下15分钟13,000转。 上清转移到一个干净的试管，并保持在冰上。 执行总蛋白测定。 准备蛋白质标准。 重组股票的牛血清白蛋白（BSA）根据制造商的指示。 准备从0-1000不等微克/毫升高纯度水稀释BCA蛋白检测的标准。 计算工作试剂的体积需要的样本数量的基础上，并复制。 例如：（8标准+ 18个未知样品）×（2％样品重复）×（0.2毫升每口井所需的试剂）= 10.4毫升所有加载到微孔板样品所需的总体积。 四舍五入到12毫升的总量，以确保足够的量。 当混合试剂与试剂的工作试剂乙，一些浊度可能发生，但应该会消失不久。 装入10μL的样品和标准，每口井。 装入井工作试剂0.2毫升。 盖封箱胶带板和摇晃30秒混合。 在37℃30分钟的板块。 酷板至室温（约10分钟）之前，在595 nm波长酶标仪上读取。 构造一个Microsoft Excel中使用与预期浓度测量吸光度的标准曲线。 一个良好的相关性系数等于或大于0.98。 计算使用从标准曲线的线性方程的样品的蛋白浓度。 样品稀释裂解液等量的蛋白质和储存于-80 ° C，直到准备作进一步处理。 蛋白质浓度范围为200-900微克/毫升根据制造商的指示。 执行多重检测。 注：复磷检测需要2天才能完成，1个小时的初始设置和一个通宵培育平板载荷bation步骤和额外的孵化和清洗步骤翌日。 地图，这口井将含有裂解根据手册中的工作表。 在室温下解冻同质化的组织样本和试剂裂解液，然后放在冰。套件提供在室温（链霉亲和珠除外），将所有的缓冲区和试剂。 准备多重检测珠。 含铝箔加上珠由轻保护盖管。为5秒，并保持在冰的涡管。 洗涤缓冲液稀释加上珠1:50。 每口井应该包含在每孔50μL总体积为49μL洗涤缓冲液1μL加上珠。 校准真空设备。 每孔100μL洗涤缓冲液清洗板。 关闭多余的液体，在2-5秒真空抽吸。 如果彻底清除缓冲区的时间或长或短，比2-5秒，相应地调整压力阀。 加入样品前彻底干板的底部。 涡5秒稀释加上珠，加50μL到指定的井。 立即真空过滤机，干板的底部用纸巾。 洗板，每孔100μL缓冲液洗两次。每次冲洗后干板的底部。 涡解冻3秒的样本，并添加50μL到指定的井。广场密封，板孵育15-18小时，避光晃动在室温下在300 RPM的磁带。 真空过滤多余的液体和洗板100μL缓冲液洗三次。每次冲洗后干板的底部。 在洗涤缓冲液稀释的检测抗体1:25。 每口井需要1μL检测抗体，在25μL的洗涤缓冲液的总体积。 放在板封箱胶带和铝箔由轻保护。摇动30秒，逐步增加速度到1100转。在室温为30分，继续在300转摇。 真空过滤板，并用100μL缓冲液洗三次。每次冲洗后干板的底部。 同时保护光板，准备足够的量，每孔加50μL1:100稀释的链霉亲和PE。由轻保护的解决方案。 涡彻底和添加，每孔50微升稀释的链霉亲和PE。孵育在1100转每分钟摇晃30秒后10分钟300转。 真空过滤多余的缓冲区。 洗板三次，每孔100μL，再悬浮缓冲。 每次冲洗后干燥彻底的板块的底部。 每孔加入125μL，再悬浮缓冲和摇匀，在1100转时为30秒。 在4 ° C避光立即​​读取盘或存储长达24小时。 5。模仿和细胞因子信号调制重组细胞因子蛋白（载体）是用来模仿的SD的变化。 冻干蛋白（如TNF -α）在-20 ° C存储长达1年 0.1％牛血清白蛋白，分装到原液稀释后的准备，储存在-20 ° C，直到3个月内使用。 片文化的任何操作都刷新至少每第三天。 细胞因子信号是沉默： 使用传统的信号级联药理剂的细胞因子; 可溶性配体拮抗剂的使用[例如，可溶性肿瘤坏死因子受体1（以上所述重组配体）]; 基因沉默[即小干扰RNA（siRNA）]。 往往是有问题的siRNA传递到神经细胞。 常见的脂质为基础的试剂，通常会导致低转染效率和细胞活力的损失。 相反，我们使用的Thermo Scientific Dharmacon ACCELL的siRNAs，高效率击倒的，无需转染试剂的使用。 在这里，我们击倒环素乙，非必需的蛋白质，在所有类型的细胞表达，使用这片文化的方法确认。 被改编成片培养贴壁细胞使用的制造商的指示交付协议。 5X siRNA的缓冲液稀释1倍，用RNase自由水。 在1x缓冲准备100μm的siRNA的解决方案环素乙siRNA是在5 nmol。在1X缓冲液50μL中悬浮股票为100微米。 混合的siRNA与ACCELL交付mediu米至终浓度1μM的siRNA。 加入11μL100微米股票的siRNA到1100μLACCELL输送介质在6孔板。 在孵化器，使温度达到平衡至少20分钟的正常孵化条件。 使用一个BSL – 2油烟机和消毒技术，传输插入到交付混合含水井。 孵育蛋白质击倒96小时交付组合。 评估免疫印迹蛋白质击倒或加剧免疫。 Western印迹，而潜在的首选击倒效率低层次的免疫信号的SD非伤害性的现象，可能是太不敏感。 因此，我们遵循负与银增强二氨基联苯胺（DAB）免疫组化和计算机为基础的光密度测量（见下文）的免疫印迹测量。 6。蛋白质组学确认建立使用免疫细胞特异性磷酸化的变化。6,7 PLP固定液组成的24小时修复切片文化： 填充到总量的80毫升10毫升16％多聚甲醛，赖氨酸1.096克，0.42克磷酸钠，和0.17克高碘酸钠，用超纯水（固定液6.2 pH值）。 24小时后，轻轻取出插入片文化与准备第一个细刷，直到转移到PBS中的叠氮化钠（100毫克/升）。 然后，切片孵育至少24小时在PBS – 20％的蔗糖，一整片文化削减到20微米的部分，并安装到凝胶涂幻灯片。 荧光免疫染色（例如，NFκB）是完成耦合晃动〜50 RPM的所有步骤如下。 3毫升PBS洗3次10分钟洗净切片文化。 放置幻灯片与安装在所有洗涤步骤〜40毫升PBS Coplin罐为20微米切片文化。 PBS洗3次，每洗10分钟洗净切片文化。 片上文化广场几滴SFX信号增强器和孵化在30分钟的湿热试验箱。 孵育2小时37片文化°兔抗NFκβ在1:100稀释0.75％抗体彗星Triton X – 100的PBS中的。 移液器抗体溶液直接到片。 从抗体溶液中取出切片和洗在PBS的3倍，每洗10分钟。 在室温下孵育1小时的羊抗兔AlexaFluor 594抗体片海卫在PBS X – 100的0.75％在1:50。 15分钟，以10,000 rpm离心AlexaFluor 594抗体，以消除任何可能在溶液中形成沉淀。 在PBS清洗，每洗10分钟三次。 浸在蒸馏水中的幻灯片从PBS冲洗掉任何盐。 盖玻片与延长抗淬灭介质，并让干燥至少2个小时，涵盖了从避光。 可视化与传统或焦（ 图7）荧光显微镜。 蛋白生产的siRNA敲除的变化可以灵敏地评估通过加强传统民建联免疫通过银激化16日和随后的光密度定量（例如，作为环素乙）（视频图2）7。 免疫亲环乙遵循标准程序，使用亮场成像，最近我们详细，7： 24小时的抗鼠亲环素B（1:100）在4 ° C; 其次是辣根过氧化物酶的二级抗体标记（1:100）; 民建联的可视化。 f是民建联的反应太微弱，让数字光密度quantification17，他们可以加强与有区别的银程序，根据奎因和Graybiel 16 。 补充水分的幻灯片，然后彻底清洗10分钟× 3高纯度水。 放置在高纯度水的幻灯片，在一个Coplin JAR和温暖至56 ° C。 准备氨硝酸银溶液（0.5％）： 股票氯化铵（25-30％）是新鲜稀释（1:1）的高纯度水。 添加氢氧化铵（〜500-600μL，每100毫升）下降与搅拌下降至0.5％硝酸银溶液，将暂时关闭多云然后清除。 温暖的解决方案，以56 ° C。 孵育10-12分钟的部分。 高纯度水（这和所有的后续步骤是在室温下使用Coplin罐）清洗15秒的幻灯片。 1％硫代硫酸钠（硫酸钠）DIP幻灯片，持续15秒。 浸幻灯片中的高纯度水，持续15秒。 音在0.2％氯化金为2分钟的幻灯片。 浸在高纯度水，持续15秒的幻灯片。 公开的幻灯片，以0.5％的草酸为2分钟。 浸在高纯度水，持续15秒的幻灯片。 治疗5％硫代硫酸钠5分钟的幻灯片。 高纯度水，脱水和盖玻片彻底洗净幻灯片。 幻灯片现在光密度量化。 所有设备，包括明亮的照明领域，为至少20分钟前成像。 一整片文化节是一个倒置显微镜成像在5 – 10X。 光强度设置为一个统一的级别（例如，〜2.6 V），并没有改变整个形象收购。 中性密度​​滤光片用于需要减少完整的图像传送一个12位的规模（0-4095），其中“0”是全黑和4095是完全白色的光强度1500〜。 数码影像，然后收购，并以电子形式储存的所有（即深水控制和实验样品），包括派生形式幻灯片区域无片文化节的背景图像。 背景图像中减去从所有图像（深水和实验）和感兴趣的区域（AOI）的周围绘制每个切片的文化和传输光的强度注册。 图像的亮度范围设置为一个常数范围为所有实验。 清晰，结果表示为相对密度比控制水平（ 图8）。 7。代表性的成果： 图1。电生理记录片文化范式。记录电极放置在CA3区锥体神经元层，然后一个双极刺激电极放置在齿状回（DG）。 图2。 CA3区诱发场电位和突触引起的扩散性抑制。 （一）实验开始与当前需要最大限度地CA3区标准领域的潜在的反应和半最大强度是用来引出CA3区诱发场电位测定。这份文件之间的准备工作诱发的突触反应的正常。如果一个片的领域兴奋后突触的潜力是不是至少有3毫伏，片丢弃。（二）下一步，反-突触诱发触发传播抑郁的阈值是确定正确的，缓慢的反应而在同一时间领域的潜力（左使用），快速响应文件准备足够的健康，按照10 Hz的刺激（例如，在快速的潜在记录的垂直偏差的幅度也类似）。 图3。胶质议案减少突触活动的证据表明，小胶质细胞的分支扩展和回缩，增加突触活动，但尚未在未受伤的脑的长途议案这些细胞突触活动。我们的研究结果，使用荧光isolectin B4显示小胶质细胞，这些细胞的一小部分在正常条件下的长距离移动的标签。此外，这些行驶的小胶质细胞的数量显着增加，当突触活动由文化接触，以河豚毒素取消在所附的图像所示。红线标记路径旅行超过6小时，与蓝色箭头标记几个模范小胶质细胞的起源期间由小胶质细胞。校准栏，50微米。 图4。 PCR筛选活动。 （一）我们使用RNA提取TRIZOL以来，在我们的手中，这个结果在显着提高（P <0.01; t -检验）一起Qiagen公司试剂盒。RNA产量比Qiagen公司试剂盒单独使用的海马脑片培养（二 ）在此外，我们定期确认，我们的RNA提取程序产生高质量的完整RNA为通过凝胶，显示了尖锐的RNA带。（c）我们使用NormFinder的软件，选择最佳的稳定性值参考基因。例如，切片文化暴露lipopolyssacharide（2小时100毫微克/毫升），三个参考基因（Rpl13a，β-肌动蛋白，18S）进行了分析。 Ct值是用来计算一个稳定值。我们的数据在这里[和使用其他扩散性抑制（数据未显示）实验表明Rpl13a是一个最佳的参照基因。 （d）我们作为一个敏感的和可重复性的手段“ΔΔCT”的方法来检测RNA折叠变化实验组之间的差异和深水控制。 图5。 PCR反应检查。 （一）我们测量稀释曲线扩增引物作为一种手段来验证PCR反应的质量。例如，最佳扩增表明一个统一的CT阈值（1-5）增加。，（二）与此相反，扩增不差引物（1-5）的统一 （C）此外，我们在执行熔解曲线结论PCR检测，以确认所需的扩增产物检测到（即单峰曲线），这表明没有任何双链DNA，包括引物二聚体，污染的DNA和misannealed PCR产物（这会出现多个峰值曲线）。 图6。纳米预扩增允许在海马脑片培养IFN -λ的检测，由于只有〜50的T细胞在切片文化（〜55,000-90,000细胞总数）发现，我们使用的 RT 2纳米PREAMP cDNA合成试剂盒的一种手段，以发现潜在的超低水平的IFN -λ表达。这意味着基因前置放大提供了一个敏感的RNA水平增加了12倍。上面显示的结果说明了前置放大能力，以提高检测的灵敏度。 Ct为参照基因Rpl13a门槛初始扩增为20.5，这是预扩增试剂盒的使用，增加了12倍，对应的cDNA PCR扩增12个循环增加至14.1。同时，干扰素-λ未检出（0.0），但探测范围内（29.0）与前置放大。 图7。先天因子途径磷蛋白磷酸化的变化。 （一）示范作用的TNF -α预处理对先天因子途径磷蛋白磷酸化的24小时（即，神经保护）兴奋毒性损伤海马脑片培养后。结果表明CA1区片之间接触N -甲基- D -天冬氨酸（NMDA）相比，那些暴露于NMDA受体单（即实验与假）3天前与100 ng / mL的TNF -α预处理的面积变化，表示为百分比。请注意，TNF -α诱导JNK和ATF – 2在持续磷酸化增加，以及在NFκB的瞬态增加（B）NFκB的激活（即，在细胞核内的磷酸化NFκB的的存在）的空间分布是由免疫透露（红色）。溜溜球污渍切片文化节[例如，在星形胶质细胞（箭头）]核绿色。因为随之而来的标记（红色）与磷酸化NFκB的锥体神经元，否则也将出现绿色，而不是黄色。校准栏，25微米。 图8。蛋白质组学确认siRNA的效率分化银集约化的过氧化物酶-二氨基环素乙的基础免疫，表明siRNA能显着（P <0.001;方差分析，霍尔姆Sidak方法）减少200，500申请后3天全球海马脑片环素B表达，或1000海里的siRNA。