新型抗癌药物使用手术标本肿瘤植的发展方法

1。介质的制备媒体准备用10％胎牛血清（16140-071 – GIBCO公司）DMEM/F-12（1X），液体1:1（10565-042 – Invitrogen公司）0.6％的琼脂溶液纯净，颗粒（1.01614.1000 – EMD的）。无菌条件下均保持在整个实验过程。 对于媒体胎牛血清5ML准备（16140-071 – GIBCO公司）加入到45mL的DMEM/F-12（1X），液体1:1（10565-042 – Invitrogen公司）50ml的最终体积。准备媒体在37 ° C的温度保持在水浴。 琼脂溶液准备用热微波法。颗粒状的琼脂0.3克，溶解于50ml蒸馏水，利用微波水。琼脂溶液降温至37 ° C的温度保持水浴。 我们用同等体积的1.2和1.3的步骤和准备原液媒体。的0.6％的琼脂（0.5ML）和10％FBS-D-MEM/F-12媒体（0.5ML）比例是1:1，在每孔6孔板的总体积为1 mL。 2。组织处理胶质母细胞瘤（GBM）的组织，共收到后立即手术病理科。从病理学教研室组织被列为大紫荆勋章。 patri板使用镊子小心被转移到组织和冰冷5ML 1XPBS洗3次。 从解剖样品切取的标本连续切片，创建瘤块，用手术刀片（羽毛- 2976＃10）和forcep（Fisher Scientific这）（直径约10毫米）。 块被转移到一个6孔板。每个井1ml含媒体提到在步骤1.4。该组织有足够的暴露在空气中不断组织可行的。 瘤块，然后注射DMSO（5％）或TMZ网站（2.5纳米），16小时在37℃，含5％CO2的加湿空气。 0.1ml的二甲基亚砜（5％）或TMZ的瘤块注射3次，一致的方式处理不同的地方。这种药物被注射使用胰岛素注射器1ML 0.37X12.7mm 28G1 / 2（点安慰- 26027）。 16小时后洗净，用5 ml的3倍1XPBS。洗涤后的块固定与10毫升10％V / V 24小时，福尔马林50毫升管（Ricca化学公司）（BASIX – 5539802）和嵌入式4μm的部分石蜡处理。 福尔马林固定部分是放置在烧杯中搅拌板与“无热”，并通过30分钟，在每一个解决方案下面的解决方案处理。 30％乙醇，50％的乙醇，75％的乙醇，80％乙醇，95％的乙醇，100％的乙醇，二甲苯等。 组织抹杀纸巾和30分钟（58至60 ° C，费舍尔Paraplast石蜡）放置在熔化的石蜡。 模具在使用Surgipath蓝丝带石蜡包埋，组织包埋组织被冷却到室温。 石蜡包埋4μm的组织切片和费舍尔加幻灯片上。 3。免疫组织化学免疫组织化学，如前面所述。 Deparaffinization和补液放置在机架的幻灯片，并执行以下步骤。二甲苯3X5分钟（5分钟的3倍），三五分钟的100％乙醇，95％为1X5分钟乙醇，70％乙醇为1X5分钟，运行3分钟自来水冲洗。 抗原修复与热诱导的抗原表位的检索沉浸在1X在一个玻璃烧杯中的蒸馏水稀释的柠檬酸缓冲液（Thermo Scientific的AP9003 – 500）的幻灯片。煮沸15分钟上的一个热点板块（确定部分唐“T脱落幻灯片）。冷却30分钟，在室温下的解决方案。冲洗用1X PBS三五分钟的幻灯片。 抑制过氧化内部沉浸在15分钟的玻璃烧杯中，用0.3％过氧化氢（费舍尔在蒸馏水科学BP2633 – 500稀释）在甲醇中的幻灯片（费舍尔科学- A – 452 – 4）。在1X PBS冲洗3X5分钟。 封锁覆盖10％正常山羊血清组织。在潮湿中传输的幻灯片和1小时在室温下孵育。三五分钟，用1X PBS清洗的幻灯片。 主要抗体孵育4 ° C的主要抗体在以下浓度：人类特定的Caspase – 3（1:1,000，研发系统，AF835），Ki67的（1:1，Dako公司，15626）与1X PBS稀释过夜。冲洗1X PBS于翌日3X10分钟的幻灯片。 二次抗体反应封面用2-3滴HRP标记二抗（设想系统）的组织。在潮湿中的幻灯片和1小时在室温下孵育。用1X PBS清洗3X10分钟。 检测发展为显色DAB试剂盒（载体实验室- SK – 4100）的初级抗体的检测，按照制造商的协议。 反染色沉浸与苏木幻灯片（10-15小号 econds，确保不“T溢出民建联信号），运行3分钟自来水冲洗。 脱水沉浸在下列顺序幻灯片，70％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，三五分钟100％的乙醇，二甲苯为3X5分钟。 盖玻片permount安装试剂（费舍尔科学SP – 15 – 100）的幻灯片。 使用奥林巴斯的荧光显微镜（DP – 72）.3.11）。在所有的实验，证实了特定的标签无一抗阴性对照。 4。代表性的成果： 我们收集的多形性胶质母细胞瘤（GBM）的手术切除标本。患者接受第一次手术前化疗不包括替莫唑胺（TMZ）。 MRI的T1加权图- 1A钆增强的形象展示在正确的术前额叶增强肿瘤。术后的图像（图1B）确认次全切除手术后的病变。手术组织被送往病理部临床诊断的目的，并根据批准的机构审查委员会（IRB）在美国俄亥俄州立大学医学中心的协议处理，其余标本组织采购。苏木精和曙红染色（H＆E）表现出坏死的存在，pseudopallisading细胞及微血管增生（图1 – C）。因此，这些肿瘤的病理诊断为大紫荆勋章。值得注意的是，以下没有TMZ网站的潜伏期长达48小时的肿瘤外植体保持GBM的细胞结构。与此相反，潜伏期为72小时或更长的时间，我们注意到，在标本的凝结核数量增加，这表明一些肿瘤细胞开始发生凋亡。因此，潜伏期较长的肿瘤组织中，失去了肿瘤细胞，这是优先观察及其周围坏死区（数据未显示）的片状区域。 为了调查，如果这些肿瘤的外植体样品能够可靠地使用药物的疗效试验的目的，我们测试了TMZ的治疗效果。图2表示在这项研究中的实验流程。最近的一项研究表明，TMZ的瘤内注射对恶性胶质瘤的生长控制效果比全身给药对这种药物的 2更有效。经过16小时的潜伏期，这些外植体嵌入石蜡连续切片染色准备。 TMZ治疗GBM的组织免疫组织化学Ki – 67的阳性肿瘤细胞表现出与对照样品相比大幅减少。反过来，免疫组织化学凋亡标记，Caspase – 3的，没有取得任何TMZ治疗脑胶质瘤标本和对照样本（图3）之间的显着性差异。 与TMZ的治疗效果得到进一步的特点相结合，在体外培养或流式细胞仪之一植体检测。具体来说，我们试图确定对干细胞样肿瘤细胞（SCLTC）的影响。因此，下列与TMZ网站瘤的治疗，我们的表现领域形成实验和流式细胞仪检测这些肿瘤植。 TMZ治疗的标本分离成单个细胞，这些单细胞接种于低密度辅以碱性成纤维细胞生长因子和EGF的无血清培养基的96孔板（每微升1细胞或更低）。在对照组中，肿瘤从肿瘤植领域的形成7天的潜伏期后观察。鉴于这一领域的形成是一个SCLTC 3 4的财产，在药物治疗肿瘤领域的改变表示SCLTC效果。同样，流量仪，分离肿瘤与细胞表面标志，CD133植进行了验证SCLTC效果。如果SCLTC在GBM的不同种类的肿瘤细胞有选择性药物治疗根除，人们可能会预测，流式细胞仪检测CD133阳性的一部分降低治疗（数据未显示）。 Figure.1磁共振图像（MRI）的病人的大紫荆勋章 。前置作业图- 1A和手术后的图- 1B的代表性人物。图- 1C是H＆E染色新鲜的大紫荆勋章的组织样本。原始的放大倍率，40X。 图。 2块培养实验的实验流图- 2A 。从病理学系的新鲜手术大紫荆勋章的图片。图2b显示了剥离瘤块，成与帮助手术刀片的10mm小块。图- 2C的药物（TMZ）治疗使用胰岛素注射器的瘤块。 E 3“/> 图。 3免疫组织化学 ，免疫组织化学与DMSO或TMZ网站注入与激活Caspase – 3和Ki67的GBM的组织块。苏木被用于核染色。原始的放大倍率，40X。