La disección del riñón adultos de pez cebra

1. La disección del riñón adultos de pez cebra a partir de una muestra de animales no fijadas Seleccione un pez cebra adultos entre los 3-6 meses de edad para la disección. La eutanasia a los peces mediante la colocación en un plato con tricaína 0,2% 7,0 pH de aproximadamente 4-5 minutos, observando cuidadosamente para ver que las branquias dejan de moverse y el corazón deja de latir. Con una cuchara, levantar los peces desde el baño tricaína en una pequeña cantidad de solución, se decanta la solución y suavemente coloque el animal en una toalla de papel. Use un par de tijeras afiladas para quitar la disección de la cabeza del animal, haciendo un corte justo detrás del opérculo branquial (Figura 1, la ruta A). Deseche la cabeza en un recipiente para residuos biológicos peligrosos. Use las tijeras para abrir la disección del cuerpo del animal, haciendo una incisión ventral largo, a partir de la cabeza y terminando en la cola en la base de la aleta caudal (Figura 1, B ruta). Quitar los órganos internos del animal con un par de pinzas de disección / fórceps, y colocarlos en los residuos de riesgo biológico. Tenga cuidado de no cepillar la pared dorsal del cuerpo, ya que este es el lugar de los riñones (Figura 2). Si ha seleccionado un pez hembra, será necesario para sacar los óvulos en desarrollo de la cavidad del cuerpo, que puede ser más fácil de hacer con un par de ángulo de fórceps o pinzas. Use agujas de disección para pin abrir las paredes del cuerpo a una bandeja de disección, y el ángulo de las patillas, para que el riñón se puede visualizar. El riñón posee una forma característica (cabeza, tronco / silla de montar, la cola) y el color, se mezcle con la pigmentación de tonalidades negro (Figura 2). También puede ver la aorta llena de sangre periférica, que corre por la línea media de la estructura de los órganos. Use unas pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal del cuerpo, utilizando un par de pinzas para levantar el riñón como órgano separado de los tejidos conectivos que lo sustentan. Con cuidado, coloque el riñón en el vehículo deseado para estudios de células vivas, tales como un tubo de microcentrífuga que contiene 1x PBS para la preparación de FACS. 2. Preparación y disección del riñón adultos de pez cebra a partir de una muestra de animales fijos Prepare una solución de 4% PBST paraformaldehyde/1X. Hervir la solución para disolver la PFA en la solución, dejar enfriar la mezcla a 4 ° C y añadir 0,1% dimetilsulfóxido. Hemos tenido el mayor éxito con la preservación del tejido recién el uso de soluciones de PFA en comparación con alícuotas congeladas. Hacer una solución suficiente para sumergir el pez cebra adulto durante la disección. Llenar una bandeja de disección con una solución de fijación suficiente para sumergir los adultos de pez cebra durante la disección. Llevamos a cabo los pasos siguientes con esta bandeja colocada bajo el microscopio, que puede ser colocado en una campana de productos químicos para minimizar la exposición a los olores de la fijación. Seleccione un pez cebra adultos entre los 3-6 meses de edad para la disección. La eutanasia a los peces mediante la colocación en un plato con tricaína 0,2% pH 7.0 durante aproximadamente 5 minutos, observando cuidadosamente para ver que las branquias y golpes parar el corazón. Con una cuchara, levantar los peces desde el baño tricaína en una pequeña cantidad de solución, se decanta la solución y suavemente coloque el animal en una toalla de papel. Use un par de tijeras afiladas para quitar la disección de la cabeza del animal, haciendo un corte justo detrás del opérculo branquial (Figura 1, la ruta A). Deseche la cabeza en un recipiente para residuos biológicos peligrosos, e inmediatamente colocar el animal en la bandeja de disección de PFA que contienen. Use las tijeras para abrir la disección del cuerpo del animal, haciendo una incisión ventral largo, a partir de la cabeza y terminando en la cola en la base de la aleta caudal (Figura 1, B itinerario circuito), y mantener el cuerpo parcialmente sumergido durante el procedimiento. Quitar los órganos internos del animal con un par de pinzas de disección / fórceps, y colocarlos en los residuos de riesgo biológico. Tenga cuidado de no cepillar la pared dorsal del cuerpo, ya que este es el lugar de los riñones (Figura 2). Use agujas de disección para pin abrir las paredes del cuerpo, y el ángulo de las patillas, para que el riñón se puede visualizar. El riñón posee una forma característica (la cabeza, silla de montar, la cola) y el color, se mezcle con la pigmentación de tonalidades negro (Figura 2). También puede ver la aorta llena de sangre periférica, que corre por la línea media de la estructura de los órganos. Fijar la muestra durante la noche, la colocación de la bandeja a 4 ° C cuando haya terminado con la organización de las muestras que desee. Al día siguiente, retire la solución de PFA de la bandeja y reemplazarla con 1x PBST. Use unas pinzas finas para separar cuidadosamente del riñón de la pared dorsal del cuerpo, usando un par de pinzas para levantar el riñón como órgano separado de los tejidos conectivos que lo sustentan. El tejido del riñón será suave y flexible del DMSO en la solución de fijación, por lo que es posible dividir el órgano del riñón entero en una sola pieza. Utilice un niveldio pipeta para colocar el riñón en un tubo de microcentrífuga. El riñón puede ahora ser tratados posteriormente para llevar a cabo montaje histológicos o en su totalidad in situ estudios de expresión génica basada en el estudio deseado. 3. Los resultados representativos: Los pasos que se esquematiza en la figura 1 indican el procedimiento de disección. El riñón puede ser identificado en base a su característica forma y coloración, y la localización anatómica en la pared dorsal de la cavidad del cuerpo del animal, como se muestra en la Figura 2. Después de la disección de una muestra fija de riñón, montar toda la hibridación in situ se puede utilizar para localizar la expresión de un gen de interés, como se muestra en la Figura 3. Figura 1: Procedimiento que permite el acceso directo para la disección del riñón adulto pez cebra. (A) pez cebra eutanasia se diseca en forma escalonada (indicado por los números y las flechas) para dar al investigador el acceso más fácil a los órganos riñón completo. Las imágenes de la cavidad abdominal antes (B) y después (C) la extracción de los órganos abdominales. Figura 2:. Visualización del riñón del pez cebra en una muestra no fijadas Tras la eliminación de órganos en la cavidad del cuerpo, el riñón aparece como un solo órgano, aplanado que se adhiere a la pared dorsal del cuerpo a través de los tejidos conectivos (A), y ha sido esquematizado (B) para mostrar su forma anatómica. Figura 3: Todo el montaje hibridaciones in situ realizadas en el órgano renal del adulto entero. (A) cadherin17 transcripciones se detectan en los túbulos de las nefronas del riñón adulto, ampliada en (A) (B). Transcripciones mafba se localizan proximal tipos de células nefrona en el riñón adulto (en comparación con los túbulos todo en el panel A). (B ' ) Una visión ampliada de expresión mafba revela que las transcripciones son específicamente localizada en el podocito (P), las células de la sangre del filtro (glomérulo) y túbulo contorneado proximal (PCT).