La detección de placas neuríticas en el modelo de la enfermedad de Alzheimer ratón
Summary
Una de las características patológicas de la EA es la formación de placas de proteína amiloide β neuríticas positivo. En este protocolo se describen dos métodos de detección de placas neuríticas en ratones transgénicos modelo de AD: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thioflavin S.
Abstract
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común que lleva a la demencia. La formación de placas neuríticas es una de las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer. El componente central de las placas neuríticas es una pequeña proteína llamada proteína filamentosa β-amiloide (Aß) 1, que se deriva de la escisión proteolítica secuencial de la proteína precursora beta-amiloide (APP) por β-secretasa y γ-secretasa. La hipótesis amiloide implica que Aγ que contienen las placas como el mecanismo subyacente a la patología tóxica en el año 2. El análisis post-mortem de la presencia de placas neuríticas confirma el diagnóstico de la EA. Para avanzar en nuestra comprensión de la neurobiología Aγ en la patogénesis de AD, las distintas cepas de ratón que expresan AD relacionados con mutaciones en los genes APP humana se generaron. Dependiendo de la severidad de la enfermedad, estos ratones desarrollan placas neuríticas en las diferentes edades. Estos ratones herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis y desarrollo de medicamentos que puedan afectar a la vía de procesamiento de APP y la formación de placas neuríticas. En este protocolo, que emplean un método inmunohistoquímico para la detección específica de las placas neuríticas en ratones modelo de AD. En especial, analizará la preparación de la extracción del cerebro medio, la fijación de paraformaldehído, muestras criostáticas, y dos métodos para detectar las placas de neuróticos en el año ratones transgénicos: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thiofalvin S.
Protocol
Discussion
Inmunohistoquímica utilizando la biotina etiquetados manchas anticuerpo 4G8 placas neuríticas en el año modelo ratones con especificidad. El resultado de tinción permite la cuantificación y la comparación de la carga de placa entre los diferentes grupos de tratamiento. Hay varios pasos cruciales que podrían afectar el resultado. Debido a que el cerebro hemisferio no son perfundidos antes de la extracción del cráneo, se debe tener cuidado durante el proceso de extracción con el fin de evitar daños en el cerebro hemisferio. Por otra parte, ya que el cerebro es hemi pasivamente perfusión, se recomienda la incubación en PFA al 4% durante al menos 48 horas a 4 ° C antes de sumergirse en la solución de sacarosa al 30%. Por otra parte, la perfusión transcardial se podía hacer antes de la extracción del cerebro. Si el cerebro se fija correctamente, debe tener una textura gomosa. En el caso de que el cerebro no está correctamente instalada, las secciones fácilmente desgarro en la solución de D'Olomos o durante los procedimientos de tinción.
El anticuerpo monoclonal 4G8 es reactiva a los residuos de aminoácidos 17-24 de la Aß y reconoció el epítopo en la secuencia principal (VFFAE). Desde 4G8 se deriva de las especies del ratón, se tiende a dar una mayor tinción de fondo. Por lo tanto, se optó por incubar las secciones a la dilución indicada con consideraciones para lograr una verdadera señal de reducir al mínimo la tinción de fondo.
Además de la inmunotinción para la detección de placas neuríticas el uso del anticuerpo 4G8, un método de tinción thioflavin S también se utiliza para identificar las placas. Thioflavin S es una mezcla de tinte homogéneo que resulta de la metilación del dehydrothiotoluidine con ácido sulfónico. Thioflavin S no se une selectivamente a los contenidos beta hoja de proteínas, como los oligómeros de amiloide. Tras la unión, thioflavin sufre un cambio azul característico de su espectro de emisión. Por el contrario vinculante thioflavin S a las formas monoméricas no provocará un cambio de color azul y no podía ser detectado con microscopio de fluorescencia. Tinción thioflavin S ofrece una alternativa rápida para la detección de amiloide como la intensidad de la fluorescencia permite una buena visualización de pequeñas cantidades de depósitos de amiloide. Sin embargo, un inconveniente de manchar thioflavin S es la falta de especificidad. Muchos componentes de otros tejidos como las hojas que contienen beta extenso, como fibrinoids, hialino, queratina, etc, tienen una afinidad más bien por medio de contraste.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), la familia Townsend, y Brown y Jack Investigación de la Familia Alzheimer de la Fundación (a WAS). WS es el titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en la enfermedad de Alzheimer. PTTL con el apoyo de las Ciencias Naturales y Asesor de Investigación en Ingeniería y la Fundación Michael Smith de Becas de Investigación en Salud.
Materials
| Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
| Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
| Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
| Entellan | EM science | 65037-71 |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
Referenzen
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- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer’s disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer’s disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
