रीयल टाइम में ट्यूमर में Nanoparticle तेज intravital इमेजिंग का प्रयोग का मूल्यांकन
Summary
हम एक उपन्यास मानव xenografted एक एवियन भ्रूण मॉडल में गतिशील, वास्तविक समय intravital इमेजिंग का उपयोग ट्यूमर के vasculature में nanoparticle स्थानीयकरण यों दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
अल्ट्रासाउंड, एमआरआई, पीईटी और सीटी के रूप में ट्यूमर इमेजिंग, के लिए वर्तमान प्रौद्योगिकियों ट्यूमर में nanoparticle तेज सूक्ष्म 1,2,3 स्तर पर मूल्यांकन के लिए उच्च संकल्प छवियों उपज करने में असमर्थ हैं, एक उपयुक्त xenograft मॉडल की उपयोगिता पर प्रकाश डाला जो में विस्तृत तेज विश्लेषण प्रदर्शन. यहाँ, हम उच्च संकल्प intravital इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एक संशोधित, खोल कम चिकन भ्रूण मॉडल में मानव ट्यूमर xenografts में nanoparticle तेज का मूल्यांकन. चिकन भ्रूण मॉडल में vivo विश्लेषण में विशेष रूप से इन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह मानव ट्यूमर के विकास का समर्थन करता है, अपेक्षाकृत सस्ती है और आवश्यकता नहीं है 4,5 anesthetization या सर्जरी नहीं है . ट्यूमर कोशिकाओं 7 दिनों के भीतर पूरी तरह से vascularized xenografts फार्म जब chorioallantoic (सीएएम) झिल्ली 6 में प्रत्यारोपित. परिणामस्वरूप ट्यूमर गैर इनवेसिव वास्तविक समय, उच्च संकल्प इमेजिंग कि या तो मेजबान या ट्यूमर सिस्टम पर थोड़ा प्रभाव के साथ 72 घंटे के लिए बनाए रखा जा सकता द्वारा कल्पना हैं. आकार और योगों प्रशासित ट्यूमर को बाहर का की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ नैनोकणों कल्पना और वे खून के माध्यम से प्रवाह के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, टपकाया ट्यूमर वाहिका से extravasate, और ट्यूमर साइट पर जमा. हम यहाँ लोबियाम्लान मोज़ेक) वायरस (CPMV लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक और / या polyethylene glycol (खूंटी) पॉलिमर 7, 8, 9,10,11 के साथ सजाया से व्युत्पन्न नैनोकणों के विश्लेषण का वर्णन. नसों में प्रशासन पर, इन वायरल नैनोकणों तेजी से endothelial कोशिकाओं द्वारा भली भाँति रहे हैं, दोनों बाहर vasculature की वैश्विक लेबलिंग और ट्यूमर 7,12 के भीतर जिसके परिणामस्वरूप. वायरल नैनोकणों के PEGylation अपने आधे जीवन प्लाज्मा बढ़ जाती है, रक्त परिसंचरण में अपने समय फैली हुई है, और अंततः बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) 7 प्रभाव, 10,11 के माध्यम से ट्यूमर में अपनी संचय बढ़ाता है. दर और एक ट्यूमर में नैनोकणों के संचय के हद समय पर मापा जाता है छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. इस तकनीक में एक विधि दोनों कल्पना और मानव ट्यूमर में nanoparticle गतिशीलता यों प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
एवियन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) संवहनी गतिशीलता और मानव ट्यूमर की फार्माकोकाइनेटिक्स का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल है. और सीएएम की संरचना की स्थिति उच्च गुणवत्ता छवि अधिग्रहण की अनुमति देता है और आक्रामक शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं के बिना कैंसर xenografts के कई प्रकार के accommodates है. इसके अलावा, कैंसर ट्यूमर xenografts chorioallantoic vascularized 7 दिनों के भीतर बन झिल्ली में प्रत्यारोपित, एक तेजी से, कम खर्चीला और अर्द्ध उच्च throughput ट्यूमर ऊतकों में नैनोकणों के संचय का आकलन करने का मतलब की पेशकश की. चूंकि कैंसर खोल कम चिकन भ्रूण के सीएएम में प्रत्यारोपित xenografts एक ईमानदार epifluorescence या confocal खुर्दबीन, प्रासंगिक और लौकिक ट्यूमर vasculature में nanoparticle तेज के बारे में जानकारी की उच्च संकल्प प्रकाशिकी के लिए सुलभ हैं आसानी से प्राप्त किया जा सकता है. इस मॉडल में कैंसर xenografts सीएएम भर laterally बढ़ने, ट्यूमर है कि बड़े होते हैं, जबकि गहराई में कम से कम 200 मीटर की शेष में जिसके परिणामस्वरूप करते हैं. इस intravital इमेजिंग के लिए उन्हें अच्छी तरह से अनुकूल विशेष रूप से करता है क्योंकि मानक epifluorescence सूक्ष्मदर्शी प्रभावी ढंग से पूरा ट्यूमर जन घुसना कर सकते हैं. इसके विपरीत, माउस के भीतर या तो सतही या orthotopic साइटों में प्रत्यारोपित ट्यूमर तीन आयामों में पैदा, यह मुश्किल सही गैर इनवेसिव तकनीक द्वारा इन ट्यूमर के भीतर गहरे नैनोकणों स्थानीयकरण करने के लिए बना. हम इस मॉडल का उपयोग किया है क्वांटम डॉट्स, liposomes, और लोहे के आक्साइड मानव ट्यूमर xenografts की एक संख्या में नैनोकणों के तेज का आकलन करने के लिए, इस मॉडल के लिए क्षमता पर प्रकाश डाला nanoparticle योगों का एक व्यापक रेंज के vivo विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन # CCSRI 700537 अनुदान और CIHR # JDL और NIH / NCI अनुदान # CA120711-01A1-Z CA120711-01A1 84535 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सभी प्रयोगों नियमों और संस्थागत पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और कैलिफोर्निया के सैन डिएगो, पशु की देखभाल के विश्वविद्यालय में समिति का प्रयोग करें और वेस्टर्न ओंटारियो विश्वविद्यालय में प्रयोग.
Materials
| Reagent Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport, VWR | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf model 5810R | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE healthcare life sciences | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Amersham Pharmacia | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE healthcare life sciences | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Biorad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa |
N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR | 16004-300 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR | 25608-203 | |
| Formalin | Bioshop | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher; Tissue Tek | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica CM 3050 S | 14047033518 |
Referenzen
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