Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation
Summary
Biz dorsal kök ganglion dokusundan kromatin immunoprecipitation aksonal yaralanma sonrası için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşım, belirli bir transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri ve periferik ve santral sinir sistemi hem de yaralı aksonların rejenerasyonu için histon ve DNA önemli epigenetik modifikasyon tanımlamak için kullanılır.
Abstract
Periferik sinir sistemi (PNS), bu yaralanma sonrası sınırlı bir ölçüde (Teng ve ark, 2006), rejenerasyon yaparken, merkezi sinir sistemi (MSS) aksonlar rejenere yok . PNS (Makwana ve ark, 2005) yaralanması üzerine yeniden neurite ve aksonal akıbet transkripsiyonel programları için gerekli olduğu kabul edilmektedir. Ancak, in vivo nöronal gen regülasyonu analiz araçları sınırlı ve genellikle zorlu .
Dorsal kök gangliyon (DRG), santral sinir sistemi ve PNS hem de aynı soma kaynaklanan bir çatallı akson tarafından innerve çünkü mükemmel bir yaralanma model sistem sunmaktadır. Ganglionlar tüm transkripsiyonel olaylar meydana hücre gövdeleri ayrı bir toplama temsil eder ve bu nedenle kolay ve tekrarlanabilir hayvan çıkarılabilir transkripsiyonel aktivitesini açıkça tanımlanmış bir bölge. Aksonal rejenerasyon meydana PNS (örneğin siyatik sinir), sinir lifleri Sakatlık rejenerasyon yerde (örneğin omurilik almaz MSS benzer bir yaralanma yanıt, farklı bir dizi transkripsiyonel programları ortaya .) Histon, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve yaralanma ya PNS veya MSS çıkan DNA modifikasyonu Siteleri kromatin immunoprecipitation (ChIP) ile karakterize edilebilir.
Burada, aksonal yaralanma sonrasında sabit fare DRG doku kullanarak ChIP protokol açıklar. Bu güçlü kombinasyon, aksonal rejenerasyonu teşvik için gerekli yanlısı rejenerasyon kromatin ortamı tanımlamak için bir araç sağlar.
Protocol
Discussion
Bu protokol doğrudan aksonal yaralanma aşağıdaki yetişkin sinir sisteminde aksonal rejenerasyon sırasında kromatin çevre ile ilgili sormak için bir yöntem sağlar. PNS veya merkezi sinir sistemi ya da yaralanma sonraki transkripsiyonel ve epigenetik bir ortam probu ile kromatin immunoprecipitation DRG yaralanma modeli içermektedir. Sevdikleri transkripsiyon faktörü bağlayıcı varsayılan siteleri karakterize etmek istiyorum ve bu sitelerin doluluk hasarına yanıt olarak oluşup oluşmadığını belirlem…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz ince ayar ChIP için yaptığı katkılardan dolayı laboratuar ve Ricco Lindner ilk ChIP deneyleri Andrea Tedeschi yardım için teşekkür etmek isterim. Bu çalışma, Hertie Vakfı tarafından desteklenen; Fortune Grant, Tübingen Üniversitesi, ve DFG DI 1497/1-1 hibe (tüm Simone Di Giovanni verilen).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Referenzen
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
