चूहे में Cajal नेटवर्क (आईसीसी) के बीचवाला कक्ष के दृश्य
Summary
Cajal (आईसीसी) के बीचवाला कोशिकाओं जठरांत्र संबंधी मार्ग (जीआई) के पेसमेकर की कोशिकाओं रहे हैं. वे चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाद ganglionic neuronal सैनिक सिकुड़ना विनियमित फाइबर के बीच जटिल नेटवर्क के रूप में. यहाँ, हम immunofluorescence पार के अनुभागीय तरीकों और पूरे माउंट murine आईसीसी नेटवर्क के दृश्य प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Cajal (आईसीसी) के बीचवाला कोशिकाओं mesenchymal व्युत्पन्न जठरांत्र (सैनिक) पथ है कि सहज धीमी peristalsis के लिए आवश्यक तरंगों को पैदा करते हैं और आंतों का तंत्रिका system1 से neuronal इनपुट मध्यस्थता के "पेसमेकर कोशिकाओं" हैं. आईसीसी के विभिन्न उपप्रकारों सैनिक पथ 2,3 के पेशीकला में अलग नेटवर्क के रूप में. हानि या इन नेटवर्कों को चोट गतिशीलता 4 विकारों के एक नंबर के साथ जुड़ा हुआ है. आईसीसी कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली और किट immunostaining पिछले 15 वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है आईसीसी नेटवर्क 5,6 लेबल पर किट रिसेप्टर tyrosine kinase व्यक्त करते हैं . महत्वपूर्ण बात, सामान्य किट गतिविधि आईसीसी 5,6 विकास के लिए आवश्यक है . आईसीसी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल stromal ट्यूमर में कोशिकाओं परिणाम (जिस्ट), कि बार – बार लाभ के समारोह किट 7,8 म्यूटेशनों बंदरगाह के neoplastic परिवर्तन. हमने हाल ही में पता चला कि ETV1 एक वंश विशेष के अस्तित्व आईसीसी / जिस्ट वंश में व्यक्त कारक है और एक मास्टर transcriptional और जिस्ट 9 tumorigenesis के लिए दोनों सामान्य आईसीसी नेटवर्क के गठन के लिए आवश्यक नियामक है . हम आगे दिखाना है कि यह tumorigenesis में किट म्यूटेशनों को सक्रिय के साथ सहयोग. यहाँ, हम चूहों में आईसीसी के नेटवर्क के दृश्य के लिए, मोटे तौर पर पहले प्रकाशित 10,11 प्रोटोकॉल पर आधारित विधियों का वर्णन. हाल ही में, क्लोराइड चैनल 1 anoctamin (ANO1) भी 11,12 आईसीसी की एक विशिष्ट झिल्ली मार्कर के रूप में लक्षण वर्णन किया गया है . अपने प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण के कारण, दोनों प्रोटीन के immunofluorescence आईसीसी नेटवर्क कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम निश्चित जमी cyrosections और पूरे माउंट तैयारी द्वारा आईसीसी के नेटवर्क के दृश्य का वर्णन.
Protocol
Discussion
Cajal के बीचवाला कोशिकाओं शुरू सैंटियागो Ramóón y Cajal द्वारा ठीक एक सदी पहले विशेषता methylene नीले और चांदी जठरांत्र पेशीकला के chromate दाग का उपयोग कर. Cajal शुरू सोचा था कि आईसीसी उनकी प्रक्रियाओं के आधार पर न्यूरॉन्स कि axons और dendrites की याद ताजा कर रहे हैं. कई आगामी वर्षों में, आईसीसी जीव विज्ञान के अध्ययन है कि किट की खोज न केवल आईसीसी में व्यक्त किया है जब तक विशिष्ट मार्करों की कमी के द्वारा सीमित किया गया है, लेकिन यह भी अपने विकास के लिए 6 आवश्यक है. तब से, किट immunofluorescence व्यापक रूप से किया गया है आईसीसी जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है और भी मूत्राशय के रूप में अन्य सिकुड़ा अंगों में आईसीसी की सराहना करने के लिए नेतृत्व. हाल ही में, ANO1 एक दूसरे विश्वसनीय आईसीसी मार्कर के रूप में पहचान की गई है.
Immunofluorescence का उपयोग करने के लिए आईसीसी की पहचान विभिन्न निर्धारण और बढ़ते तकनीकों का उपयोग पिछले 15 साल से अधिक कई प्रकाशनों किया गया है. हमारे हाथ में "निर्धारित जमी" cryosections कि paraformaldehyde और संरक्षित sucrose के साथ लगाया गया है सबसे अच्छा या cryosectioning बाद पोस्ट – निर्धारण paraformaldehyde एसीटोन की तुलना में काम करता है. पूरे mounts के लिए, हमने पाया है कि एसीटोन निर्धारण mucosal विच्छेदन के बाद सबसे मजबूत परिणाम देता है.
ऐतिहासिक, ACK-2 माउस आईसीसी पहचान के लिए पसंद की किट एंटीबॉडी किया गया है. यह एक मोनोक्लोनल चूहा है कि कोशिकी डोमेन पहचानता है और यह भी एक अवरुद्ध एंटीबॉडी कि आन्त्रावरोध का कारण बनता है जब चूहों को जीने के लिए दिया है. हालांकि, मिलान ACK-2 धीरे धीरे paraformaldehyde निर्धारण द्वारा नष्ट हो जाता है और मानक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति विधियों द्वारा बचाया नहीं है. हमने पाया है कि मिलान ACK-4 paraformaldehyde निर्धारण के लिए प्रतिरोधी है. आकारिकी तय जमे हुए ब्लॉक और वर्गों, आयल एम्बेडेड ब्लॉक और वर्गों की तुलना में बेहतर बरकरार रखता है और अधिक लंबे शब्द संग्रह (चित्रा 4) के लिए उत्तरदायी है. न तो ACK-2 और न ही ACK-4 सफलतापूर्वक किया गया है पैराफिन वर्गों में प्रयोग किया जाता है. हम विशेषता है कि D13A2, एक नया खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, GI पथ के दोनों तय स्थिर और आयल वर्गों में असाधारण अच्छी तरह से काम करता है.
किट melanocytes, hematopoietic कोशिकाओं, जर्म कोशिकाओं, और विशेष रूप से मस्तूल कोशिकाओं में जो भी GI पथ में पाया जाता है सहित कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त किया है. सौभाग्य से, सबसे मस्तूल कोशिकाओं पाए जाते हैं और पेशीकला में नहीं mucosa है. खरगोश विरोधी Ano1 और चूहे विरोधी किट के साथ डबल प्रत्येक एंटीबॉडी का धुंधला धुंधला गैर विशिष्ट (चित्रा 4) को समाप्त कर सकते हैं. यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि किट और Ano1 आईसीसी के उपवर्गों के बीच के रिश्तेदार अभिव्यक्ति अलग लगता है लायक है. उदाहरण के लिए, छोटी आंत में, किट धुंधला गहरी मांसपेशी जाल के आईसीसी की तुलना में जबकि Ano1 धुंधला तुलनीय है myenteric आईसीसी में ज्यादा तीव्र है.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (K08CA140946, YC के लिए), (5F32CA130372, पीसी के लिए), (R01CA102774 और R01HL055748 पंजाब), रक्षा विभाग (PC094302 YC), जिस्ट अनुसंधान के लिए शुमन परिवार फंड (करने के लिए द्वारा समर्थित किया गया पीसी), और स्टार कैंसर कंसोर्टियम (पीसी के लिए, YC, CLS और पीबी). हम Katia Manova, Ning फैन, और MSKCC आण्विक कोशिका विज्ञान कोर सुविधा के Mesurh Turkekul cryosectioning और immunostaining के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | Becton Dickison | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | EM Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
Referenzen
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
