Неинвазивный метод отбора проб волос для получения высоких ДНК Качество от Неуловимый мелких млекопитающих

1. Волосы ловушки До создания малого барабана, идеальное место должно быть определено в пределах среды обитания пищуха или осыпи склона. Это включает в себя сеном сваи, которые растительности кэши, животных собирают в конце лета, а также свежие scats найти на сайтах уборную. Полоски упаковочной ленты (10-50см в длину) катят для предоставления 360 ° липкой поверхности и расположены в веб-образной манере, чтобы конверт вход в куче сена пищуха (рис. 1) или уборной сайта. В зависимости от конфигурации скалы, кусок лески могут быть использованы для поддержки структуры волос ловушку, но этого делать не нужно, когда вход достаточно малы (<30 см в диаметре), полное описание использования лески можно найти в Генри и Russello (2010) 3. Волосы ловушки проверяются так часто, как это возможно, и образцы волос, нанесенных на ленту (рис. 2), затем собраны и помечены. После транспортироваться обратно в лабораторию, волоски удаляются из липкой ленты использованием стерильного пинцета и переданы в криогенных труб и хранить при температуре от -20 ° C до дальнейших манипуляций. Волосы образцы группируются вдоль волос ловушку, как считается, принадлежат одному человеку, в то время образцов кластерных независимо друг от друга, как предполагается, принадлежат к разным лицам. В последнем случае волосы помещают в разные пробирки. Эти предположения в дальнейшем могут быть проверены путем ДНК-отпечатков пальцев и расчеты вероятности идентификации на основе микросателлитных генотипических данных. 2. Выделения ДНК С пищуха волосы очень тонкие и содержит крошечные лампы корень, мы уже показали, что не менее 25 волосков, должны получить достаточное количество ДНК для хорошего качества ниже по течению ПЦР-амплификации 3. Мы использовали ДНК IQ системы (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и слегка измененная версия инструкции производителя для выделения ДНК из образцов шерсти. Во-первых, волосы образец остановлен в микро-центрифуга для того, чтобы избежать потери волос при открытии трубки. Затем инкубационный раствор готовят путем смешивания 80 мкл инкубационного раствора с 10 мкл из DTT (1M) и 10 мкл протеиназы К (18ng/ml), приведет к конечной концентрации 0,1 М ДТТ и 1.8ng/ml инкубации протеиназы К. Решение (100 мкл) добавляется к образцу и инкубировали при 56 ° С в течение 1 часа. В то же время лизиса раствор готовится путем добавления 1 мкл DTT (1M) на каждые 100 мкл лизирующего буфера, в результате чего конечная концентрация DTT 0,01 М. Приготовленный раствор лизис (200 мкл) добавляется к образцу, а также 7 мкл смолы ДНК IQ, перемешивали в течение 3 секунд на высокой скорости и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут. Образец затем перемешивают в течение 2 секунд и вставляется в магнитном стенд, где разделение магнитных гранул из раствора. Остальные раствор затем атмосферный и отбрасываются, стараясь не мешать магнитных гранул смолы. Затем образец обрабатывали 100 мкл приготовленного раствора лизис, встряхивали и вернулся в магнитных стенд, где происходит разделение снова. Лизис буфера атмосферный и отбрасываются, и этот шаг повторяется три раза использованием промывочного буфера (100 мкл). Образец впоследствии высохнуть в магнитном стенде в течение 15 минут. После высыхания, 100 мкл элюирующего буфера добавляется в образец и инкубировали при 65 ° С в течение 5 минут. Образец перемешивали и вставляется в магнитный стенд. Решение теперь содержащие элюируют ДНК затем переведен в 1,5 мл трубки Эппендорфа и хранить при температуре от -20 ° C до дальнейших манипуляций. ДНК из образцов печени также извлекали с помощью системы IQ ДНК и использовать в качестве положительного контроля для амплификации ПЦР. 3. ПЦР-амплификации ДНК, полученной от наших неинвазивной ловушку волос и печеночных проб были затем использованы для усиления набор часто используемых молекулярных маркеров (микроспутник, AFLP, митохондриального цитохрома В и ZFX / ZFY определения пола маркер). ПЦР проводили с использованием Veriti термоциклер (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) в 25 мкл тома, содержащего: 10 – 20 нг ДНК, 0,5 мкМ каждого праймера, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 200 мкМ дНТФ, 10 μ бычьего сывороточного альбумина (БСА; Новой Англии Биолабс, Ипсвич, Массачусетс, США) и 0,5 U AmpliTaq Золотой ДНК-полимеразы (Applied Biosystems). Велоспорт параметры микросателлитных локусов были оптимизированы с помощью программы приземления езда на велосипеде (10 мин при 95 ° C, 35 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 30 с отжигом, и 45 с при 72 ° С, после чего последний шаг при 72 ° С в течение 10 мин). Температуры отжига уменьшается на 1 ° C за один цикл от 60 до 55 ° С до достижения шестой цикл, после чего оставшиеся 29 циклов продолжали при 55 ° C. Велоспорт параметры митохондриальной фрагменты, как описано выше, но состояла из 35 циклов с отжигомтемпературе 50 ° C. Усиленный полиморфизма длины фрагмента был проведен следующий протокол для позвоночных геномов описывается Бонин 4. Наконец, молекулярные определения пола проводился с помощью ПЦР-ПДРФ из ZFX / ZFY локусов с HinfI рестрикции пищеварения 5. ПЦР-продукты из микроспутников, AFLPs и цитохром B последовательности проводились на ABI 3130XL генетического анализатора (Applied Biosystems), в то время переваривается ZFX / ZFX фрагменты были бежать рядом с 100 б.п. лестницы (New England Biolabs) на 3% агарозном геле, содержащем 2,5% SYBR безопасного геля ДНК пятна (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и визуализируется использованием RED персональная система визуализации геля (Альфа Иннотек, Сан-Леандро, штат Калифорния, США). Микроспутник и AFLPs были визуализированы использованием Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) и митохондриальной ДНК хроматограмме визуализированы использованием Sequencher v4.7 (Gene кодекс корпорации, Энн Харбор, Мичиган, США). 4. Представитель результаты ДНК, извлеченной из волос образцов, полученных с помощью нашего неинвазивной ловушки были использованы для ПЦР усиления различных типов молекулярных маркеров. В качестве основы для сравнения, ДНК извлекали с помощью печеночных проб усиливался вместе с нашими образцами волос. Ядерная локусов микроспутник были успешно усиливаются для волос и печеночных проб (рис. 3). Хотя интенсивность сигнала была выше при использовании образцов печени, это не имело негативного влияния на генотип скоринга (рис. 3). Аналогичные результаты были получены при использовании AFLPs (рис. 4), митохондриальная ДНК (рис. 5) и ZFX / ZFY молекулярный маркер определения пола (рис. 6). Рисунок 1. Пример неинвазивной ловушку волос создана на сене кучу. Полоски засучив ясно упаковочной ленты расположены в веб-подобным же образом вложить вход в сено кучу. Кусок лески используется здесь, чтобы предоставить дополнительную помощь для волос ловушку. Рисунок 2. Успешных ловушку волос, содержащие большое количество волос прилипли к упаковочной ленты. Рисунок 3. Представителем ядерной хроматограмме микроспутника (Ocp6) 8, как показано на Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Топ хроматограмма была получена путем усиления ДНК из ткани печени, и является гетерозиготной (354/358) в этом локусе. Нижней хроматограмме представляет различные индивидуальные выставки гетерозиготных генотипов (358/362) на основе ДНК, извлеченной из волос. В то время как сигнал хроматограмме от волос образца меньшей интенсивностью, чем печень образца, генотип забил не пострадали от этой разницы в сигнале. Рисунок 4. Представителем хроматограмме AFLP (E31T32), как показано на Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Топ хроматограмма была получена путем усиления ДНК из тканей печени, нижней хроматограмме представляет ДНК, извлеченной из волос. Рисунок 5. Представителем митохондриальной ДНК хроматограмме (цитохром B), как показано на Sequencher v4.7 (Gene кодекса Corporation). Топ хроматограмма была получена путем усиления ДНК из тканей печени, нижней хроматограмме представляет ДНК, извлеченной из волос. Рисунок 6. Представителем молекулярный маркер определения пола (ZFX / ZFY) усиливаются и для печени и образцы волос. Этот подход основан на наблюдении, что хромосома Y обладает сайта HinfI ограничение в этом регионе, что Х-хромосомы не хватает. Таким образом, самки производят два сопредседателя, мигрирующие фрагментов 432 б.п., а мужчины производят фрагментов 432 б.п., 261 б.п. и 171 б.п..