A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

1. Laço de cabelo Antes da criação de um laço, um local ideal deve ser determinada dentro do habitat pika ou inclinação do tálus. Isto inclui montes de feno, que são caches vegetação que recolhem os animais no final do verão, bem como fezes frescas encontradas em locais de latrina. Tiras de fita de embalagem (10-50cm de comprimento) são enrolados para prover uma superfície de 360 ​​° pegajosa e são organizados de uma forma como a web-envelope a entrada para o monte de feno pika (Fig. 1) ou site latrina. Dependendo da configuração das rochas, um pedaço de linha de pesca podem ser utilizados para apoiar a estrutura do laço do cabelo, mas esta muitas vezes não é necessário quando as entradas são muito pequenas (<30 cm de diâmetro), uma descrição completa do uso de linha de pesca podem ser encontrados em Henry e Russello (2010) 3. Armadilhas cabelos são verificados o mais rápido possível, e amostras de cabelo depositados na fita (Fig. 2) são então coletados e rotulados. Uma vez transportado para o laboratório, os pêlos são removidos da fita adesiva com a pinça estéril e transferido para tubos criogênicos e armazenadas a -20 ° C até a manipulação posterior. Amostras de cabelo agrupados ao longo de um laço de cabelo são considerados como pertencentes a um único indivíduo, enquanto amostras de cluster são assumidos de forma independente de pertencer a indivíduos diferentes. Neste último caso, o cabelo é então colocado em tubos diferentes. Estas suposições podem depois ser testados por meio de impressões digitais de DNA e cálculos de probabilidade de identidade com base em dados de microssatélites genotípica. 2. Extração de DNA Desde que o cabelo pika é muito fino e contém uma lâmpada pequena raiz, temos mostrado previamente que um mínimo de 25 cabelos são obrigados a obter uma quantidade suficiente de DNA de boa qualidade para amplificação por PCR downstream 3. Utilizou-se o DNA de QI sistema (Promega, Madison, WI, EUA) e uma versão ligeiramente modificada de instruções do fabricante para o isolamento de DNA de amostras de cabelo. Em primeiro lugar, a amostra de cabelo é girada para baixo em uma centrífuga de micro-, a fim de evitar a perda de cabelo durante a abertura do tubo. Então a solução de incubação é preparada misturando 80 ml de solução de incubação com 10μl da TDT (1M) e 10μl de proteinase K (18ng/ml) para resultar em uma concentração final de 0,1 M DTT e 1.8ng/ml de Proteinase K. Incubação solução (100 l) é adicionado à amostra e incubados a 56 ° C por 1 hora. Nesse meio tempo, a solução de lise é preparada por adição de 1 ml de DTT (1M) para cada 100 mL de tampão de lise, resultando em uma concentração final de 0,01 M DTT. Solução de lise preparada (200 mL) é adicionado à amostra, juntamente com 7 mL de DNA de resina de QI, agitadas por 3 segundos em alta velocidade e incubadas em temperatura ambiente por 5 minutos. A amostra é então centrifugadas por 2 segundos e inserido no suporte magnético, onde a separação das esferas magnéticas da solução ocorre. A solução restante é então aspirado e descartado, tomando cuidado para não perturbar o pellet de resina magnética. A amostra é então tratada com 100 ml da solução de lise preparada, agitadas e voltou para o stand onde a separação magnética ocorre novamente. O tampão de lise é aspirado e descartado, e este passo é repetido três vezes usando um tampão de lavagem (100 l). A amostra é posteriormente deixada a secar no suporte magnético por 15 minutos. Depois de seco, 100 ml de tampão de eluição é adicionado à amostra e incubados a 65 ° C por 5 minutos. A amostra é agitadas e inserido no suporte magnético. A solução agora contendo o DNA eluída é então transferido para um tubo Eppendorf 1,5 ml e armazenadas a -20 ° C até manipulações mais. DNA de amostras de fígado também foi extraído usando o sistema de QI DNA e usado como um controle positivo para amplificações PCR. 3. Amplificação por PCR O DNA obtido a partir de nosso laço do cabelo não-invasivo e amostras de fígado foram então usados ​​para amplificar um conjunto de comumente utilizados marcadores moleculares (microssatélites, AFLP, mitocondrial citocromo B e ZFX / ZFY marcador sexagem). PCRs foram realizadas utilizando um ciclador térmico Veriti (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) em um volume 25 mL contendo: 10 – 20 ng de DNA, 0,5 mM de cada primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 mM dNTPs, 10 μ albumina sérica bovina (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) e 0,5 U AmpliTaq DNA polimerase Gold (Applied Biosystems). Parâmetros para o ciclismo loci microssatélites foram otimizados usando um programa de ciclismo touchdown (10 min a 95 ° C, 35 ciclos de 95 ° C por 30 s, 30 s de anelamento, e 45 s em 72 ° C, seguido por uma etapa final a 72 ° C por 10 min). A temperatura de anelamento diminuiu 1 ° C por ciclo de 60-55 ° C até atingir o sexto ciclo, altura em que os 29 ciclos restantes continuaram a 55 ° C. Parâmetros de ciclismo para os fragmentos foram mitocondrial, como descrito acima, mas consistia de 35 ciclos com um recozimentotemperatura de 50 ° C. Polimorfismo comprimento de fragmento amplificado foi realizada seguindo o protocolo de genomas de vertebrados descritos por Bonin 4. Por último, sexagem molecular foi realizada utilizando a PCR-RFLP de ZFX / ZFY loci com a enzima HinfI digestão restrição 5. Os produtos de PCR do microsatélite, AFLPs e seqüências do citocromo B foram executados em um analisador genético ABI 3130XL (Applied Biosystems), enquanto digerida ZFX / ZFX fragmentos foram executados ao lado de uma escada bp 100 (New England Biolabs) em um 3% agarose gel contendo 2,5% gel DNA SYBR Safe. mancha (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e visualizados através de um sistema de imagem pessoal RED gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA) Microssatélites e AFLPs foram visualizados usando Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) e do cromatograma DNA mitocondrial foi visualizado usando Sequencher v4.7 (Gene Código Corporation, Ann Harbour, Michigan, EUA). 4. Resultados representativos O DNA extraído de amostras de cabelo utilizando o nosso laço não-invasivos foram usados ​​para PCR amplificar vários tipos de marcadores moleculares. Como base para comparação, utilizando DNA extraído de amostras de fígado foi amplificado ao lado de nossas amostras de cabelo. Loci microssatélites nucleares foram amplificados com sucesso tanto para cabelos e amostras de fígado (Fig. 3). Embora a intensidade do sinal foi maior quando se utiliza a amostras de fígado, este não ter um efeito adverso sobre a pontuação genótipo (Fig. 3). Resultados semelhantes foram obtidos quando se utiliza AFLPs (Fig. 4), seqüências de DNA mitocondrial (Fig. 5), eo ZFX / ZFY marcador sexagem molecular (Fig. 6). Figura 1. Um exemplo de um laço de cabelo não-invasivo criado em uma pilha de feno. Tiras de fita adesiva enrolada clara de embalagem são organizados de forma web-like para delimitar a entrada para o monte de feno. Um pedaço de linha de pesca é aqui utilizado para fornecer suporte adicional para o laço do cabelo. Figura 2. Um laço de cabelo bem sucedida contendo um grande número de cabelo preso à fita de embalagem. Figura 3. Um cromatograma microssatélites representante nuclear (Ocp6) 8 como mostrado na Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). O cromatograma top foi obtida pela amplificação do DNA do tecido do fígado, e é heterozigoto (354/358) neste locus. O cromatograma inferior representa um indivíduo diferente exibindo um genótipo heterozigoto (358/362) com base em DNA extraído de cabelo. Enquanto o sinal de cromatograma da amostra de cabelo tem uma intensidade menor do que a amostra de fígado, marcando o genótipo não é afectada por esta diferença de sinal. Figura 4. Um cromatograma AFLP representante (E31T32), como exibido na Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). O cromatograma top foi obtida pela amplificação do DNA de tecido hepático, o cromatograma fundo representa o DNA extraído de cabelo. Figura 5. Cromatograma A seqüência representante do DNA mitocondrial (citocromo B), como exibido na Sequencher v4.7 (Gene Código Corporation). O cromatograma top foi obtida pela amplificação do DNA de tecido hepático, o cromatograma fundo representa o DNA extraído de cabelo. Figura 6. Um marcador de sexagem representante molecular (ZFX / ZFY) amplificado para fígado e amostras de cabelo. Esta abordagem se baseia na observação de que o cromossomo Y possui um sítio de restrição HinfI nesta região que o cromossomo X não tem. Assim, as fêmeas produzem dois co-migração de fragmentos de 432 pb, enquanto os machos produzem fragmentos de 432 bp, bp 261 e 171 bp.