Summary

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Published: April 04, 2011
doi:

Summary

En korunmuş dizileri biyoinformatik analizleri ile tespit hedefleyen evrensel bir antikor kullanarak influenza virüs hemaglutinin ve nöraminidaz miktarının tayini için basit bir yuva blot yöntemi geliştirilmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tüm viral hemaglutinin ve nöraminidaz kantitatif tayini için kullanışlı bir alternatif sunabilir.

Abstract

Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), viral bir yaşam döngüsü ve koruyucu immün yanıtları 1,2 indüksiyonu önemli rol oynadığı bilinmektedir grip virüsleri iki yüzey proteinleri. HA nötralize edici antikorlar için ana hedef olarak, şu anda grip aşısı potens belirteci olarak kullanılır ve tek radyal immunodiffüzyon (SRID) 3 ile ölçülür . Ancak, ilgili alt tip spesifik antiserumlar durumu SRID bağımlılığı her yeni aşı serbest bırakılması için en az 2-3 ay gecikme neden olur. Ayrıca, NA da, koruyucu bağışıklığı 4, influenza aşılarının NA miktarını uygun reaktifler analitik yöntem 5 eksikliği nedeniyle henüz standart değil uyardığı kanıtlara rağmen . Böylece, HA ve NA antijenleri nicel kapasitesine sahip basit bir alternatif yöntemler hızlı serbest bırakılması ve influenza aşıları daha iyi kalite kontrol için arzu edilir.

Mevcut tüm influenza A HA ve NA dizileri Evrensel korunmuş bölgelerde 6-7 biyoinformatik analizleri ile tespit edilmiştir. Bir dizisi (Uni-1 olarak belirlenen), iki korunmuş dizileri, enzimatik aktif sitesine yakın (HCA-2 olarak belirlenmiş) ve nöraminidaz tespit ise, füzyon peptid 6 HA, sadece evrensel korunmuş epitop tespit edildi N-terminalindeki diğer yakın (HCA-3 olarak belirlenmiş) 7. Bu amino asit dizileri ile Peptitler sentezlenen ve antikor üretimi için tavşan bağışıklık kullanılır. HA Uni-1 epitop karşı antikor HCA-2 ve HCA-3 bölge (NA) karşı antikorlar 9 NA alt tipi bağlama kapasitesine sahip iken 13 alt tipi influenza A HA (H1-H13) bağlamak mümkün oldu. Tüm antikorlar allantoik proteinlere karşı çapraz reaktivite tespit edildiğini gözlem kanıtladığı gibi viral dizileri karşı olağanüstü özgüllük gösterdi. Bu evrensel antikorlar daha sonra spesifik antiserumlar 7,8 gerek kalmadan aşılar influenza A HA ve NA ölçmek için slot blot testleri geliştirmek için kullanılmıştır. Aşı örnekleri çeşitli konsantrasyonlarda seyreltilmiş referans standartları ile birlikte bir yuva leke aparatı kullanarak PVDF membran üzerine uygulandı. HA tespiti için, örnekler ve standart ilk seyreltilmiş edildi Tris tamponlu salin (TBS), NA ölçümü için% 0,01 olarak Zwittergent bu koşulları içeren TBS seyreltilmiş iken 4M üre içeren algılama hassasiyetini önemli ölçüde geliştirilmiş. HA ve NA antijenleri kendi evrensel antikorlar ile immün tespiti sonrasında, sinyal intensitesi dansitometrisi tarafından ölçüldü. HA ve NA aşıların miktarları daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda kullanılan referanslar sinyal intensitesi ile kurulmuş bir standart eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır.

Bu antikorların, HA ve NA evrensel epitoplar bağlamak göz önüne alındığında, ilgilenen araştırmacılar sadece slot leke dışında immunoassay araştırma araçları olarak kullanabilirsiniz.

Protocol

1. Reaktifler ve ekipmanların hazırlanması Yuvası leke işlemine başlamadan önce, Tris-tamponlu salin (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6) (TBS)% 0.01 hemaglutinin HA, yuva leke, ya da 20_mls Zwittergent 4M üre çözeltisi 20_mls hazırlamak TBS, nöraminidaz veya NA, yuvası leke çözüm. 4M üre her zaman taze olarak hazırlanması gerekir iken,% 10 Zwittergent dH 2 O bir stok solüsyonu oda sıcaklığında en az 6 ay için kararlı ve bu nedenle her bir deney önce TBS içinde% 0.01 seyrel…

Discussion

Influenza virüs HA ve NA, bu iki yüzey proteinleri bağışıklık yanıtlarını 6-11 indükleyen en önemli viral bileşenler olduğundan kantitatif tayin aşı araştırma ve geliştirme için kritik öneme sahiptir . Daha önce bu proteinlerin tespiti için rapor immünolojik yöntemler, gerginlik spesifik antikorların gerektirir. Antikorlar, sadece evrensel korunmuş epitoplar 6-8 farkındayız beri HA ve NA antijenleri burada açıklanan ölçmek için, basit, tekrarlanabilir ve hızlı yu…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarların Bayan Monika Tocchi yazının içerik incelemesi için teşekkür etmek istiyorum. AMH, Kanada, Suudi Arabistan Kültür Bürosu aracılığıyla, Kral Abdülaziz Üniversitesi Burs tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name of the reagent or equipment Company Catalogue number Comments
Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus Bio-Rad 170-6542  
Bio-Dot SF Filter paper Bio-Rad 162-0161  
Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) Millipore IPFL00010  
Vacuum pump Millipore WP6111560  
Chemiluminescence BioMax Light Film Kodak 178 8207  
FluorChem Gel Documentation System Alpha Innotech 29-008-1896X  
Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens   Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7.
Influenza vaccine reference antigen CBER/FDA or NIBSC    
Influenza vaccine samples     Commonly available in most countries
Urea Sigma-Aldrich U1250  
Zwittergent 3-14 Detergent Calbiochem 693017  
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500  
Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk Bio-Rad 170-6404  
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated Thermo Scientific 31460  
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo Scientific 34075  

Referenzen

  1. Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
  3. Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
  4. Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
  5. Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
  6. Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
  7. Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
  8. Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
  9. Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
  10. Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
  11. Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
  12. Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , (2010).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., He, R., Li, X. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), e2784, doi:10.3791/2784 (2011).

View Video