Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones
Summary
Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar repetitivas<em> En vivo</emImagen> de la médula espinal utilizando microscopía de dos fotones se describe. Este método combina un dispositivo de estabilización de la columna y un régimen anestésico para reducir al mínimo las vías respiratorias inducida por los movimientos y producir imágenes de los datos en bruto que no requieren la alineación o de otro tipo de post-procesamiento.
Abstract
Imágenes in vivo utilizando microscopía de dos fotones 1 en ratones que han sido genéticamente modificadas para expresar proteínas fluorescentes en células específicas de los tipos 2.3 ha ampliado significativamente nuestro conocimiento de los procesos fisiológicos y patológicos en numerosos tejidos in vivo 4-7. En los estudios del sistema nervioso central (SNC), ha habido una aplicación amplia de imágenes in vivo en el cerebro, lo cual ha producido una plétora de nuevos hallazgos y muchas veces inesperados sobre el comportamiento de las células como las neuronas, astrocitos, microglia, en condiciones fisiológicas o patológicas 08.17. Sin embargo, las complicaciones técnicas en su mayoría han limitado la implementación de imágenes in vivo en los estudios de la médula espinal de ratón vivo. En particular, la proximidad anatómica de la médula espinal a los pulmones y el corazón genera artefacto de movimiento significativo que hace imágenes de la médula espinal que viven una tarea difícil. </p>
Hemos desarrollado un método novedoso que supera las limitaciones inherentes de las imágenes de la médula espinal mediante la estabilización de la columna vertebral, la reducción de las vías respiratorias inducida por los movimientos y facilitando así el uso de la microscopia de dos fotones de la imagen de la médula espinal de ratón in vivo. Esto se logra mediante la combinación de un dispositivo a medida estabilización de la columna con un método de anestesia profunda, lo que resulta en una reducción significativa de las vías respiratorias inducida por los movimientos. Este protocolo de vídeo muestra cómo exponer una pequeña zona de la médula espinal de vida que se puede mantener en condiciones de estabilidad fisiológica durante largos períodos de tiempo manteniendo la lesión tisular y el sangrado al mínimo. Representante imágenes primas adquiridas en detalle vivo en alta resolución, la estrecha relación entre la microglia y la vasculatura. Una secuencia de timelapse muestra el comportamiento dinámico de los procesos microgliales en la médula espinal de ratón vivo. Por otra parte, un análisis continuo de la misma z-marco demostrars de la excelente estabilidad que este método puede lograr la generación de pilas de imágenes y / o películas timelapse que no requieren la alineación de la imagen después de la adquisición. Por último, se muestra cómo este método puede ser utilizado para revisar y crear la imagen de la misma zona de la médula espinal en los puntos de tiempo posteriores, teniendo en cuenta los estudios longitudinales en curso de los procesos fisiológicos o patológicos en vivo.
Protocol
Discussion
El método aquí descrito permite estable y repetitiva de imágenes in vivo de la densamente poblada estructuras fluorescentes celular en la médula espinal de ratones anestesiados utilizando microscopía de dos fotones. La estabilidad alcanzada es el resultado de un dispositivo de estabilización a medida la columna vertebral y un régimen anestésico que reduce las vías respiratorias inducida por el artefacto de movimiento. El dispositivo de estabilización de la columna permite el espacio para resp…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple conceder RG4595A1 / T para DD y las subvenciones del NIH / NINDS NS051470, NS052189 y NS066361 a las figuras KA y películas adaptadas y / o reimpresión de Dávalos et al., J Métodos Neurosci. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, con permiso de Elsevier.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
| Betadine | Fisher | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
Referenzen
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