בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans
Summary
פרוטוקול לחתוך נוירונים<em> ג elegans</em> עם לייזר פעמו MicroPoint מוצג. אנו מתארים הקמת המערכת, משתק תולעים ניתוק שכותרתו נוירונים. היתרונות כוללים מערכת יחסית בעלות נמוכה ויכולת לנתק תהליכים עצביים או תאים לכרות<em> In vivo</em>.
Abstract
נוירונים לתקשר עם תאים אחרים באמצעות אקסונים דנדריטים, הרחבות קרום דק המכילים התמחויות טרום או פוסט סינפטי. אם נוירון הוא נפגע על ידי פציעה או מחלה, עלול להתחדש. גורמים סלולרי פנימי חיצוני להשפיע על היכולת של תא עצב להתחדש ולשקם את תפקוד. לאחרונה, נמטודות ג elegans התפתחה אורגניזם מודל מצוין לזהות גנים איתות המסלולים המשפיעים על התחדשות של נוירונים 1-6. הדרך העיקרית ליזום התחדשות הנוירונים ב C. elegans היא חיתוך לייזר בתיווך או axotomy. במהלך axotomy, תהליך עצבי fluorescently שכותרתו היא הכרות באמצעות אנרגיה גבוהה פולסים. בתחילה, התחדשות הנוירונים ב C. elegans נבדקה באמצעות לייזר femtosecond מוגבר 5. עם זאת, מחקרים התחדשות לאחר מכן הראו כי לייזר פעמו קונבנציונליים יכולים לשמש במדויק לנתק נוירונים in vivo ו לתגובה משובי דומה 1,3,7.
אנו מציגים פרוטוקול לביצוע in vivo לייזר axotomy ב התולעת באמצעות MicroPoint פעמו לייזר, מערכת סוהר זמינה וכי כבר בשימוש נרחב עבור אבלציה תא ממוקד. אנו מתארים יישור לייזר, מקבע את התולעים, חיתוך נוירונים ספציפיים, והערכת התחדשות הבאים. המערכת מספקת את היכולת לחתוך מספר גדול של נוירונים תולעים מרובות במהלך הניסוי אחד. לפיכך, לייזר axotomy כפי שמתואר במסמך זה מערכת יעילה לייזום ניתוח תהליך של התחדשות.
Protocol
1. הרכבת מערכת רכיבים ספציפיים של המערכת שלנו המפורטות להלן. כאשר התאספו כהלכה, המשתמש צריך להיות מסוגל למקד את המיקרוסקופ ביד אחת, להזיז את הבמה עם אחרים (או עם העכבר או ג'ויסטיק), להפעיל את הלייזר עם דוושת רגל, יש תצוגה ברורה של ב- מסך התמונה. MicroPoint לייזר רכוב לנמל עלית פלואורסצנציה של מיקרוסקופ המתחם. אנו משתמשים 80i ניקון, אבל כל היקף המחקר כיתה זקוף או הפוך אמור לעבוד. מערכת MicroPoint יכלול dichroic אישית, אשר אמור להתאים fluorophore כי תוויות התאים שאתה רוצה לחתוך. תאים חיתוך שכותרתו עם fluorophores חלופה דורש dichroics נוספים. בנוסף, גנרטור הדופק ואת דוושת רגל מגיעים עם מערכת MicroPoint. 100x, 1.4 NA אובייקטיבי הנפט לביצוע ניתוח והערכת התחדשות, בתוספת מטרות נוספות לפי הצורך לאיתור מדגם בשקופית. אנו משתמשים Apo תוכנית Nikon VC לניתוח, ולמצוא כי 4x שימושי התמקדות גס למצוא את המדגם. ממונע הבמה עם ג'ויסטיק. הבמה עם דיוק גבוה מאוד הדירות היא מיותרת, שכן בשלב משמש רק מיקוד. אנו משתמשים לפני OptiScan II (ראה דיון). מצלמה. המצלמה צריכה לספק מסגרת הדולר מספיק כדי להתמקד ביעד neurite שכותרתו במטרה 100x, בעוד לדמיין את התמונה על צג המחשב. אנחנו מעדיפים הפחתת האור תאורה במהלך ההליך axotomy כדי למנוע תופעות בלבול פוטנציאליים צילום הלבנה או נזק (ראה 1.7, להלן). לפיכך, המצלמה צריכה להיות רגישה מספיק כדי להכיל את רמת האור מופחת. אנו משתמשים אורקה Hamamatsu 05G, ולמצוא כי הדמיה הרץ 16.3 מספיקה. מצלמות Equivalent יוכל להחליף אותו. מחשב, צג, הדמיה תוכנה שיכולה להסיע את המצלמה. בנוסף, אנו משתמשים בתוכנות הדמיה כדי לתפעל את הבמה ממונע עם עכבר (ראה דיון). האוויר השולחן. דרישה זו עשויה להשתנות בהתאם למיקום, אבל מאז הניתוח מבוצע במטרה 100x, אנו מוצאים בידוד רעידות להיות חיוני. אספקת אור עם מדריך קל מנגנון תריס עבור הארת fluorophore. המדריך אור יצרף MicroPoint. מנגנון תריס הוא שימושי כדי להפחית את עוצמת התאורה באופן עצמאי של הלייזר. אנו משתמשים Lumen לפני 200 או לייקה EL6000 ו להחליש עד 80% של עוצמת האור הכוללת axotomy. 2. לייזר ההתקנה פרוטוקול מפורט בתחילה ליישר ולהתמקד הלייזר מסופק עם מערכת הלייזר MicroPoint. אנו מניחים כי הנוהל כבר אחרי בהצלחה על ההגדרה הראשונית. זה כולל יישור לייזר עם הכוונת של העינית. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור תחזוקה שוטפת של המוקד של לייזר בעוצמה. כאמור במדריך MicroPoint, לייזר חנקן פעמו מסוגל לפגוע קשות העין האנושית. יש להקפיד לא להביט ישירות לתוך קרן לייזר. לאחר ההתקנה, את המסנן מחסום צריך לחסום קרינה בבטחה דרך מהעיניות. חיתוך נוירונים אורגניזם בגודל של גרגר חול יכול להיות מאתגר. מאז שטח של הנזק שנגרם על ידי הלייזר הוא קטן מאוד, חשוב לדעת את מיקום תלת ממדי של המיקוד של הלייזר על מנת למקד את המדגם בדיוק. ההתמקדות לייזר נמצא בשימוש השקופית מראה. ראשית, עלינו לבדוק את המיקום z של המוקד לייזר תואם את המיקוד של הנתיב הדמיה. בשלב הבא, מיקום xy של מוקד הנזק מסומן הכוונת בתוכנת הדמיה. התמקדות ב-z מטוס Push בצפיפות נייטרלי לסנן ND16 (איור 1 א). אנו משתמשים במסנני צפיפות ניטרלי בנתיב עלית תאורה כדי להחליש את לייזר תוך התמקדות. שכן, אפילו עדינה התמקדות, לדחוף הן ND16 ו ND4 מסננים ניאון. הגדר את הלייזר MicroPoint לדופק 1 עם הבורר פנה 'בחר' (איור 1b), ולאחר מכן להעביר את הגלגל כדי לסנן את המתאים ארוך לעבור מחסום מסנן (איור 1 ג'). מניחים את השקף מראה על הבמה ולהתמקד pinholes בתוכה במטרה 4X באמצעות האור המועבר. מוסיפים טיפת שמן טבילה לשקופית שיקוף ו להתרכז על pinholes במטרה 100x. פתח את תריס המצלמה עם השביל אופטי מיתוג ידית (איור 1d) ואת תריס לייזר (איור 1e). אם יש צורך, להפחית את עוצמת האור המועבר כך את הקצוות של pinholes הם פריך: זה יסייע התמקדות בדיוק. לחצו על דוושת רגל. זה אמור לייצר חור קטן במראה אם לייזר ממוקדת כראוי. פוקוס מיקרוסקופ מעט מעל המטוס של השקופית שיקוף ולירות לייזר שוב. זה אמור לעשות עוד יותרחור מאשר הירייה הראשונה, או משאירים שום סימן בכלל. חזור על ידי התמקדות מתחת לשקופית שיקוף. אם חור לא מיוצר 2.5, או אם החור גדול יותר מופק כאשר ההתמקדות מעל או מתחת לפני השטח של המראה, ולמקד את הלייזר עם טבעת פוקוס על הראש אבלציה. ודא כי החור עדיין מיושר כראוי עם הכוונת של העינית. עם שימוש עקבי, מוקד Z-המטוס לעתים רחוקות צריך להיות מותאם. התמקדות במישור xy בצע את שלבים 2.1 עד 2.3 לעיל ולחץ על דוושת הרגל כדי לעשות חור קטן להחליק את המראה. ליזום "בשידור חי" מצב ללכוד מ 'רוכשת את' רכיבי התפריט. ב "מדוד" סרגל הכלים ובחר "ההחזר על ההשקעה עורך ', ולאחר מכן בחר בכלי' צלב כפול 'וגרור את הכוונת כדי ליישר אותם עם חור במרכז החדש. לחץ על 'שמור ROI "ואז" העורך יציאה "ולחדש מצב ללכוד Live. הפעל את ההגדרה 'עכבר XY "אלמנטים כדי לתפעל את הבמה עם העכבר. משוך את מסנן צפיפות ניטרלי (ים) חזרה למצב המקורי (ים), להגדיר את פעימות לייזר עד 10, ולהסיר את השקופית מראה. כוונון העוצמה של הלייזר הכוח של הלייזר צריך להיות מותאם הכוח המינימלי הדרוש כדי לחתוך את העצב על פי בחירתך. התאם את הכוח על ידי העברת צלחת מחליש (איור 1f) תוך צמצום תולעים חיים (המתואר להלן). אם כוח לייזר גבוה מדי, זה יגרום נזק היקפי או לפוצץ חור התולעת. אם כוח לייזר נמוך מדי, זה לא יהיה לנתק את תא העצב. לאחר מערכת הוגדר, מחליש את העמדה לעתים רחוקות צריך להיות שונה. אם הלייזר הופך חלש, מחליש את הצלחת צריך להתרגש להמשיך חיתוך, זה יכול להיות סימן לכך לצבוע בתא צבע צריך להיות מוחלף (ראה דיון). 3. לשתק את התולעים הכן פתרון של 3% agarose מותך M9 (KH2PO4 22mm, Na2HPO4 42mM, NaCl 85mm, 1mm MgSO4). לוותר על 5 מ"ל של agarose מותכת לתוך שפופרת 15 מ"ל בז. מלאו אחר צינור עם מים. צינורות מקום גוף חימום מודולרי מוגדר 55 ° C. מלאו את החימום עם מים ליצירת אמבטיות מים מיני עבור כל צינור. הערה: agarose ניתן להכין בכמויות גדולות מראש מחדש נמס לניסויים הבאים. מניחים שתי שכבות של סרט תיוג על כל שתי שקופיות שקופיות נקי בין שקופיות אלה. לוותר על ירידה של agarose בעזרת פיפטה נורה פלסטיק לאמצע השקופית נקי במקום אחר בניצב השקופית הראשונה, כך שהתקבל agarose כרית הוא בעובי של שני חלקים של סרט (איור 2). הסרת אחת משתי השקופיות מהפנקס לאחר 30 שניות. לשטוף ולאחסן את פיפטה פלסטיק בצינור בז מלא מים לשימוש עם שקופיות עוקבות. המקום הבא, 3-5 μL של 0.10 מיקרומטר או 0.05 קלקר חרוזים מיקרומטר במרכז כרית. הוסף תולעים 5-10 לבטא חלבון פלואורסצנטי של נוירונים של עניין. אם הנוירונים עניין מופצים סימטרית בצד ימין או שמאל של התולעת, השתמש לבחור פלטינה להפוך תולעים כך שהצד הנכון הוא פונה כלפי מעלה. תולעים יש להציב בשקופיות תוך 10 דקות הכנת כריות agarose. בזהירות במקום להחליק לכסות על התולעים. לאחר שהניח את תלוש לכסות, לא להזיז אותו יחסית משטח agarose כמו זה ישבש את לציפורן ולהרוס את התולעים. מניחים את השקף מוכן על הבמה מיקרוסקופ. 4. גזור נוירונים אור ישיר לתוך מהעיניות עם מנוף נתיב אופטי מיתוג. פוקוס על התולעת להיות לחתוך במטרה 4X, במקום טיפת שמן על להחליק את המכסה, ולעבור המטרה 100x. החזר את הנתיב האופטי של המצלמה. השתמש בעכבר כדי להזיז את נוירון על פי בחירתך תחת במרכז הכוונת. לחצו על דוושת רגל לירי לייזר לנתק את תהליך עצבי. במידת הצורך, שני סטים של פולסים ניתן לנתק את תא העצב. תחילה, כדאי לעקוב בדיוק איזה נוירונים נותקו בשנת תולעים הפרט כדי להעריך התחדשות הבאים. כאשר מבוצע כהלכה, לייזר axotomy מייצרת הפסקה קטנה הנוירון מבלי לגרום נזק משמעותי ברקמת העור שמסביב או נוירונים אחרים (ראה איור 3). במקרים מסוימים, צלקת קטנה עלול להיווצר סביב האתר של פציעה. שחזר את התולעים על ידי הסרת מכסה מחליק בתנועה כלפי מעלה ישיר, נזהר כי התולעים נשארים על כרית agarose. האם לא להחליק את coverslip משם. לאחר מכן, חותכים את הכרית סביב תולעים עם מחט באף מלקחיים ומניחים את החלק של agarose על צלחת טרי NGM seeded המכיל OP50 8. מקום 10 μL של סטרילית M9 על כרית לשחרר את התולעים מן החרוזים ולהסיר agarose. 5. ציון נוירונים להתחדשות הכן agarose כרית כפי שתואר בשלב 2.2. המקום תולעים 3-5 μ L חרוזים קלקר. החלת coverslip. ניתן להכין שקופיות ברצף, או לחילופין את כל התולעים ניתן להכין מראש את השקופיות שמרו על תרבות מאכלים 10 ס"מ, כל אחד המכיל Kimwipe לח כדי לשמור על לחות agarose. השתמש אובייקטיבי 100x לדמיין את הנוירונים ניתק. ב נוירונים רבים, גדם העצבית דיסטלי לאתר לחתוך יישאר. אנו משתמשים נוכחות של שארית זו אינדיקציה כי אכן נותק נוירון (איור 4). הנוכחות של גדם זה מאפשר להבחין בין תא עצב, כי כבר לחתוך מחדש מאחד שלא היה לחתוך. הערה: גם את גדמי דיסטלי ו הפרוקסימלי בתחילה לסגת לאחר לחתוך. הערכת התחדשות. מגוון של פרמטרים ניתן לקבוע. אחת assay פשוטה היא אם נוירון נפגע נוצר חרוט צמיחה (איור 4 א) ו – מחדש, או לא (איור 4 ב). לחלופין, אורך neurite ניתן לעקוב ולהשוות. 6. נציג תוצאות כדוגמה, אנו מתארים ואפיון של התחדשות של חומצה γ-aminobutyric (GABA) הנוירונים המנוע. אלו נוירונים, אשר מתגוררים חוט העצב הגחון ולהאריך תהליכים circumferentially אל חוט העצב הגבי, חיוניים לתנועה נכונה 9. נוירונים GABA ניתן דמיינו ידי הבעת fluorophore מקודדים גנטית, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), תחת שליטה של -47 או UNC UNC -25 מקדמי (זנים EG1285 ו CZ1200, בהתאמה, זמינים C. elegans גנטית מרכז ). הר L4 בשלב תולעים כמתואר, להעיף את התולעים כך נוירונים GABA על צד ימין שלהם פונה כלפי מעלה, והמקום להחליק לכסות. חותכים 1-3 של commissures האחורי באמצע הדרך כל תולעת, בין מיתרי הגבי ו הגחון. הימנע חיתוך commissures החוצות או fasciculate עם commissures אחרים, כמו אלו קשה להבקיע מאוחר יותר. שחזור תולעים כמתואר. 18-24 שעות לאחר axotomy מוצלח, תולעים יהיה התאושש מהניתוח ולהציג locomotory נורמלי ההטלה התנהגויות. בטל תולעים, כי הם מתים או חולים. טען מחדש את שארית כמתואר, ולהעריך התחדשות. בדרך כלל אנו שואפים להעריך לפחות 30 נוירונים לחתוך בכל תנאי הניסוי. ב oxIs12 בעלי חיים, בדרך כלל 60-70% של L4 נוירונים GABA ניתק יהיה יזם חרוט צמיחה מבנה, שמעידים הרחבה של קרום בקצה הרחבה ואת הענפים neurite אחדות, נדד ממקום בסלע (איור 4 א). במקרים רבים, את הקונוסים הצמיחה תהיה היגרו להתחבר עם חוט העצב הגבי, השליכה נוירונים סמוכים, או את הגדם דיסטלי. יתרת 30% של נוירונים תהיה יזם או אין צמיחה, ויצרו גדם הפרוקסימלי לאתר של axotomy, או יהיה המורחבת רק filopodia קטן (איור 4 ב). באיור 1. UV פעמו מערכת הלייזר axotomy. רכיבים ספציפיים הם: (א) מסנני ND (ב) הדופק בורר (ג) מנוף גלגל לסנן (ד) נתיב אופטי מיתוג מנוף (ה) תריס לייזר (ו) צלחת מחליש. איור 2. הכנת כרית agarose. כדי להכין משטח agarose בעובי הרצוי, שתי שכבות של סרט (ירוק) מונחות על שתי שקופיות. שקופית ממוקם בין שתי הראשון, ירידה של agarose מתווסף אז לשקופית נקי. לבסוף, החלק הרביעי הוא ממוקם בניצב שלושת הראשונים, וכתוצאה מכך הפנקס כי הוא בעובי של שני חלקים של סרט. איור 3. נציג GABA נוירון axotomies. בניסוי טיפוסי, GABA commissures נוירון נותקו באמצע ההיבט לרוחב של התולעת. השליכה הכרות מוצגת מיד לפני (פאנל משמאל) לאחר axotomy (פאנל מימין). כל התמונות צולמו במטרה שמן 100x. איור 4. תוצאות נציג axotomies GABA נוירון. 24 שעות לאחר הכרות axotomy אקסונים הם הבקיע עבור התחדשות. האקסון התחדשות עם חרוט צמיחה (חץ) מוצג (א) זמן לא התחדשות האקסון נתפסת גדם הפרוקסימלית (חץ) ב (ב). הגדם הדיסטלי של האקסון כל לחתוך מוצג בלוח זה (ראש החץ) ו אינדיקציה כי האקסון כבר ניתק.
Discussion
מגוון של מערכות לייזר שימשו לחתוך neurites ב C. elegans, וכן מספר מחקרים בחנו את הביצועים שלהם בפירוט 3,7,10,11. הלייזר MicroPoint השתמשו בפרוטוקול שלנו היא מערכת סוהר כי הוא קל להקים ולתחזק, והוא זמין במחיר נמוך לחוקרים לעומת מערכת לייזר TI-Sapphire. לעומת מערכת TI-Sapphire, לעומת זאת, הלייזר MicroPoint צפוי לגרום נזק שטח גדול יותר, אשר עשוי להיות נחות עבור יישומים מסוימים. אם מערכת TI-Sapphire הוא הרצוי, פרוטוקול מעולה על בניית מערכת כזו זמין 12.
הפרוטוקול הנוכחי יכול להתבצע על מגוון רחב של הנוירונים ב C. elegans, עם זאת, נציין, כי ההבדלים ביכולות משובי בין סוגים שונים של נוירונים צפויים 13. בנוסף, רקע מהונדס שונים יכולים להשפיע על ההצלחה רגנרטיבית. למרות אחוז התחדשות הנוירונים GABA הוא עקבי למדי בין זנים שונים סמן מהונדס, שציינו עלייה קלה הכוללת התחדשות ב juIs76 14 לעומת 15 oxIs12 תולעים. הבדלים בין סמנים של הנוירונים לגעת גם תוארו 2.
אנחנו מעדיפים כדי לשתק את התולעים עם microbeads במקום הרדמה כמו חרוזים את התוצאה מהר immobilization עקבית יותר 16. זהו גם יתרון כאשר אנו מסוגלים להתבונן התחדשות ללא כל תופעות בלבול אפשרי בשל הרדמה 17. שיטה חלופית ללא הרדמה עבור immobilization הוא השימוש התקנים microfluidic. השימוש מיקרופלואידיקה עבור axotomy תוארה בהרחבה 17-22.
אנו מוצאים כי עם שימוש עקבי, את הפונקציות לייזר הטוב ביותר כאשר coumarin 440 בתא צבען משתנה פעם בשבוע כל ביצוע ההליך המתואר במדריך MicroPoint. אם יש צורך, המחוון הנחתה ניתן להשתמש כדי להגדיל את כוחו, אבל זה עשוי להיות אינדיקציה צבע ישן או חוסר לייזר. כמו כן, יש לצבוע תאים חיים מוגבל, שבסופו של דבר צריך להיות מחדש או להחליף (ראה פתרון בעיות).
זה יכול להיות קשה לתמרן את neurite היעד תחת הכוונת המציינים את המיקוד לייזר, במיוחד אם החיה היא משותקת באופן חלקי. אנו מוצאים כי שלב ידני אינו אופטימלי למטרה זו, למרות שהוא שמיש בהחלט. בשלב ג'ויסטיק שבשליטת ממונע מדויק יותר, אנו מוצאים כי באמצעות תוכנה שתומכת תמונה גרירה עם העכבר כדי להזיז את הבמה ממונע הוא הטוב ביותר. אלמנטים Nikon מספק תכונה זו מתוארת בפרוטוקול זה, אבל את החבילה Micromanager חינם, כמו גם תוכנות הדמיה אחרות, ייתכן פונקציונליות דומה. דרך אחרת של מיקוד בסדר היא להעביר את המיקוד לייזר, ולא החיה. קרן מנגנון היגוי גלונומטר זמין כמו תוספת על הלייזר MicroPoint, אם גישה זו היא המועדפת.
מלבד היישום שלה ללימוד התחדשות עצבית, הלייזר יכול לשמש כדי לכרות סוגי תאים אחרים, כגון העור, השריר, או תאים מיוחדים, או לשבש סינפסות עצביות ספציפיות 23-27. יתר על כן, המסלולים המווסתים את התנוונות הנוירונים המלווה פציעה או מחלה יכולה להיחקר עם מערכת זו. ככזה, את השימוש של לייזרים פעמו ימשיכו לשפוך אור על שני גורמים גנטיים השינויים הביולוגיים המאפשרים לתא התחדשות העצבית ותהליכים רלוונטיים אחרים.
פתרון בעיות:
המתואר כאן כמה בעיות נפוצות ופתרונות הקשורים בהם.
- הלייזר אינו גזירה כראוי. זה צפוי כי גם לייזר הוא מחוץ לפוקוס (ראה סעיף 2), או לצבוע בתא צבע צריך להיות מוחלף (ראה MicroPoint ידנית). לחלופין, התא לצבוע ייתכן שיהיה צורך להחליף או מחדש.
- התולעים עוברים על agarose כרית. זהו בדרך כלל סימן לכך משטח agarose לח מדי. אנו מוצאים כי רפידות צריך להיות שמאל במשך כ 30 שניות לפני תולעים ממוקמים להם לעקוף את הבעיה הזו. אתה יכול גם לנסות להשתמש בגודל קטן יותר (0.05 מיקרומטר) microbeads.
- ההתאוששות של תולעים קשה ולא יעיל. זה יכול להיגרם על ידי הסרת coverslip שגוי או על ידי כרית agarose יבש. אם כרית הוא יבש מדי, אתה עשוי להבחין כי האקסונים לפתח מראה חרוזים. במקרים מסוימים, זה בגלל התולעים לא הונחו על משטח די מהר אחרי זה נעשה. לחלופין, המניה הישנה של פתרון agarose אולי ריכוז גבוה מ -3% לאחר ההיתוך חוזרות ונשנות.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה במעבדה Hammarlund ממומנת על ידי: NIH מענקים NS066082 R01-01 ו T32GM007223, קרן Beckman, ואת רפואי אליסון קרן.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 0.05 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 08691 | |
| 0.10 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose GPG/LE | American Bioanalytical | 00972 | Ultra pure |
| Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352057 | 17 x 100 mm style, nonpyrogenic |
| Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides | Erie Scientific Company | 420-004T | 3″ x 1″ x 1 mm |
| Cover Slips | VWR | 48366 205 | 18 mm x 18 mm No. 1 1/2 |
| KIMTECH Science Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish | BD Biosciences | 351029 | |
| Tape blank 3/4w x 500L | TimeMed | T-512 | |
| Immersion oil | Nikon | Type A, nd=1.515 | |
| EG1285 or CZ1200 | C. elegans Genetic Center | http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ | |
| OptiScan II | PRIOR Scientific | ||
| NIS-Elements Ar or Br | Nikon | ||
| MicroPoint Ablation Laser System | Photonic Scientific | ||
| Compound microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Hamamatsu Camera | Hamamatsu Photonics | Model C8484-05G01 | |
| Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo | Dell | ||
| Windows XP Professional | Microsoft | Version 2002, Series Pack 3 | |
| Dual dry bath Incubator | Fisher Scientific | Analog controls | |
| 4X Plan Fluor objective | Nikon | ||
| 100X Plan Apo VC oil objective | Nikon | ||
| Dumont #5/45 forceps | Dumont | 11251-35 | Dumoxel standard tips, can also use #7 |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ800 | With NI-150 High Intensity Illuminator |
Referenzen
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).
- Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration. Cell. 138, 1005-1018 (2009).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans. Nature. 364, 337-341 (1993).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in. C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).
- Chung, S., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Applied Physics A: Materials Science & Processing. 96, 335-341 (2009).
- Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).
- Wang, Z., Jin, Y. Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology. , (2010).
- Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion. Neuron. 34, 563-576 (2002).
- McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. Identification and characterization of the vesicular GABA transporter. Nature. 389, 870-876 (1997).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. . Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5, 531-533 (2008).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).
- Samara, C. Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Nelson, F. K., Riddle, D. L. Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery. Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Entwicklungsbiologie. 78, 577-597 (1980).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Entwicklungsbiologie. 87, 286-300 (1981).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).
- Pujol, N. Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis. Current biology. CB 18, 481-489 (2008).
Diesen Artikel zitieren
Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707, doi:10.3791/2707 (2011).