Индукция аллоантигена конкретных анергии в населенных мононуклеарных клеток периферической крови путем стимуляции аллоантигена с сопредседателями стимулирующий сигнал блокады

<p class="jove_title"> 1. Подготовка РВМС</p><ol><li> Процедуры для хорошего асептики и универсальные меры предосторожности необходимо соблюдать при проведении этого протокола.</li><li> Изолят РВМС здоровых доноров добровольцев по центрифугирования в градиенте плотности использованием Ficoll-Hypaque. Кроме криоконсервированных РВМС может быть реанимирован.</li><li> Count жизнеспособной РВМС после окрашивания Голубой Трипан использованием гемоцитометра. Ресуспендируют РВМС в полном питательных сред (СМ) в концентрации 1 миллион жизнеспособных клеток / мл в 15 мл трубки Falcon.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Настройка Массовая Alloanergizing сотрудничеству культуры</p><ol><li> МНПК из двух отдельных доноров, необходимые для установки alloanergization культур. Клетки от одного донора будет служить ответчик и клеток от другого донора послужит стимулятором (называется первый стимулятор партии).</li><li> Место 10 миллионов стимулятор РВМС на 1 млн / мл в 15 мл трубки Сокол и добавить 100 мг анти-B7.1 и 100 мг анти В7.2 антител блокировать costimulation. Аккуратно агитировать трубки и инкубировать 30 минут. Инкубационный условия для этого и всех последующих шагов 37 ° С / 5% СО₂ / 80% влажности</li><li> Радиация стимулятор РВМС (3,3 Гр) и добавить к Т-25 50 см³ Клеточной культуре колбу с газопроницаемых шапку. Этикетка колбе "Массовая alloanergizing со-культуры".</li><li> Добавить 10 мл ответчик РВМС (на 1 млн / мл в КМ) в колбу.</li><li> Добавить дальнейшем 100 мг каждая из анти-B7.1 и против В7.2 антител и аккуратно перемешать до размещения колбу в вертикальном положении в инкубаторе в течение 72 часов</li></ol><p class="jove_title"> 3. Настройка управления Массовая культура сотрудничества</p><ol><li> Место 10 миллионов стимулятор РВМС (на 1 млн / мл) в 15 мл трубки Falcon.</li><li> Радиация 10 миллионов стимулятор РВМС (3,3 Гр). И добавить к 50 см³ Клеточной культуре колбу. Этикетка "Массовая контроль со-культуры".</li><li> Добавить 10 мл ответчик РВМС на 1 млн / мл в СМ в колбу и аккуратно перемешать до размещения колбу в вертикальном положении в инкубаторе в течение 72 часов.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Настройка первичного смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) для измерения эффективности применения костимулирующих блокады</p><ol><li> Эффективность костимуляторных блокады измеряется в первичной MLR который настроен с помощью РВМС от alloanergizing натуральном и контроль со-культур</li><li> Первичные MLR устанавливается на тот же день, что основная часть культуры были созданы</li><li> Во-первых этикетке один U дном 96-луночный планшет "Первичная MLR" для каждого из трех моментов времени для измерения (День 4, 5 и 6 после пластин устанавливаются).</li><li> Декантировать 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing со-культур в 15 мл пробирки Falcon.</li><li> Внесите 200 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в трех экземплярах скважин на каждую тарелку. Этикетка этих скважин "нет костимуляторных блокады (ЦБС)" для клеток из объема контроля со-культур и "ЦБС" для клеток из объема alloanergizing совместно культур</li><li> Добавить 200 мл СМ до 6 скважин на каждую пластину в качестве отрицательного контроля. 200 мл PBS добавляется ко всем пустой скважины, чтобы уменьшить испарение. Место пластин в инкубаторе.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Настройка вторичного MLR для измерения Эффективность Alloanergization</p><ol><li> 72 часов с момента создания объемных со-культур, остаточные alloresponses в alloanergized МНПК измеряются в вторичном MLR. На вторичном MLR, РВМС с обеих объемных alloanergizing совместно культура и массовый контроль со-культуры промывают и restimulated с облученным allostimulator РВМС</li><li> Чтобы настроить вторичный этикетке MLR один U дном 96-луночный планшет "Вторичные MLR" для каждого из трех моментов времени для измерения (День 3, 5 и 7 после настройки).</li><li> Удалить 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing совместно культур, трансфер в 15 мл Сокол труб и центрифуги в течение 5-10 минут при 2000 rpm.Aspirate супернатант тщательно, нарушить гранул, добавить 10 мл СМ и центрифуги клетки снова. Повторите эту стиральную шаг.</li><li> Ресуспендируют клеток в 1 мл СМ. Граф жизнеспособных клеток с использованием Голубой Трипан окрашивания, а также настроить концентрацию клеток до 1 млн. жизнеспособных клеток ответчик / мл.</li><li> Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в трех экземплярах скважин каждой пластины. Этикетка этих скважин "Первая партия (ФП) allorestimulation"</li><li> Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в дальнейшем 3 скважины на каждой пластине и маркировать эти скважины "CD3/28 стимуляции"</li><li> Для подготовки стимулятор клеток для вторичных MLR, изолировать РВМС из свежей крови (или реанимировать криоконсервированных РВМС) из того же здорового донора используется для предоставления первой МНПК стимулятор партии в alloanergizing и управления культуры.</li><li> Приостановить РВМС от донора FP в концентрации 1 млн / мл и облучать (3.3Gy)</li><li> Добавить 100 мл облученных клеток стимулятор к скважинам с надписью "FP allorestimulation"</li><li> При положительных элементов управления, добавить 1 мл каждая из CD3 и CD28 моноклональных антител и 98mL СМ к скважинам с надписью "CD3/28 стимуляции". Добавить 200 мл CM до 6 скважин на каждую пластину в качестве отрицательного контроля и 200 мл PBS, чтобы пустые колодцы. Место пластин в инкубаторе.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Измерение Специфика Alloanergization</p><ol><li> Специфика alloanergization определяется путем сравнения пролиферацию клеток, взятых из ответчик завершена alloanergizing и контроля со-культур после стимуляции облученных РВМС получить "третья сторона" здоровых доноров (например, различные доноры Первая партия) во вторичной MLR.</li><li> Label три 96-луночных "Вторичные Специфика MLR" День 3, 5 и 7.</li><li> Удалить 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing совместно культур передачи 15мл Сокол труб и центрифуги в течение 5-10 минут при 2000 оборотах в минуту. Аспирируйте супернатант тщательно, нарушить гранул, добавить 10 мл СМ и центрифуги клетки снова. Повторите эту стиральную шаг.</li><li> Ресуспендируют клеток в 1 мл СМ. счет использования Голубой Трипан окрашивания, а также настроить концентрацию клеток до 1 млн. жизнеспособных клеток ответчик / мл.</li><li> Для подготовки третьего клетки стимулятор партия для вторичной MLR, изолировать РВМС из свежей крови (или реанимировать криоконсервированных РВМС) от нового здорового донора. Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокол в трех экземплярах скважин каждой пластины. Этикетка этих скважин "TP allostimulation"</li><li> Приостановить РВМС от донора ТП на 1 млн / мл и облучать (3,3 Гр)</li><li> Добавить 200 мл облученного стимулятор клетки ТП к скважинам с надписью "allostimulation ТП»</li><li> Специфика alloanergization также может быть определена путем сравнения пролиферацию клеток, взятых из ответчик завершена alloanergizing и контроля со-культур после стимуляции инфекционных патогенов, таких как ЦМВ. На этом этапе очень важно использовать ответчик РВМС от доноров с ранее продемонстрировали пролиферативный ответ к ЦМВ лизат.</li><li> Label три 96-луночных "Вторичные MLR ЦМВ" День 3, 5 и 7.</li><li> Для подготовки ответчик клеток для вторичных MLR для измерения CMV ответы, передача 5 мл с каждой объемной контроля и alloanergizing совместно культур до 15 мл пробирок и помыть, считать и ресуспендирования на 1 млн. кл / мл в СМ, как описано выше . Внесите 100 мл клеточной суспензии из каждой пробирки Сокола в 3 скважины на каждой пластине.</li><li> Добавить 0,1 мл ЦМВ лизат в 100 мкл CM к скважинам</li><li> Добавить 200 мл CM до 6 скважин на всех пластину в качестве отрицательного контроля и добавить 200 мл PBS, чтобы пустые колодцы. Место пластин в инкубаторе.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Измерение распространения в первичный и вторичный реактивный миномет</p><ol><li> Ответчика пролиферации клеток измеряется тимидина в первичный и вторичный реактивный миномет. Распространения измеряется в 4 день, 5 и 6 после Первичные пластинки MLR настроены и на 3 дня, 5 и 7 после вторичного пластин MLR настроены.</li><li> 1mCi из тритием тимидина добавляется в ячейки 16 часов перед сбором урожая</li><li> После добавления тритием тимидина, пластины выдерживают в течение часа further16 затем собирают на фильтре мата использованием Tomtec комбайн (или аналогичный). Высушите FILTERMAT в течение одного часа, то место в камере для отбора проб, добавляют 5 мл жидкости сцинтилляционных и печатью. Прочитано пластины в Wallac Micro бета сцинтилляционных счетчиков или аналогичный.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Расчет эффективности применения костимулирующих блокады в первичной MLR</p><ol><li> Процент ингибирования (PI) первичных alloresponses рассчитывается как 100 х [означает копий в минуту в allostimulation скважин (насыпной alloanergy совместно культуры РВМС) – среднее копий в минуту в allostimulation скважин (насыпной контроль со-культуры РВМС)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. Расчет эффективности применения Alloanergization на вторичном MLR</p><p class="jove_content"> П. И. вторичных alloresponses рассчитывается как<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. Расчет Специфика Alloanergization на вторичном MLR</p><ol><li> После рестимуляции клеток с CD3 и CD28, Т. П. allostimulators или антиген, П. И. ответов на эти стимулы могут также рассчитываться по этой формуле. Это дает меру специфики процесса alloanergization</li></ol><p class="jove_title"> 11. Создание Alloanergized РВМС донора для клинического использования после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)</p><ol><li> Alloanergized РВМС донора может быть создан для клинического использования после HLA-несоответствие аллогенных ГСК с использованием протокола указано выше</li><li> При создании клеток для клинического использования, отвечающий РВМС получаются из доноров ГСК и стимулятора РВМС из ГСК получателя до пересадки.</li><li> При создании РВМС для клинического использования, все действия выполняются при надлежащей производственной Рабочие условия в аккредитованных центров обработки стволовых клеток.</li><li> Дополнительные тесты контроля качества выполняются в том числе эндотоксина анализов и Граму и культуры для удовлетворения критериям безопасности до выпуска клеток для клинического использования</li></ol><p class="jove_title"> 12. Представитель Результаты</p><p class="jove_content"> Использование несоответствующих HLA-стимулятор и ответчик РВМС, наличие костимуляторных блокады в первичной MLR снижает средний пролиферация аллогенных клеток от ответчика РВМС в день от 5 до 30% (+ / – 10%, среднее + / – стандартное отклонение), которое наблюдалось в контроль первичной MLR при отсутствии костимуляторных блокады. Это эквивалентно означает торможение первичного пролиферация аллогенных клеток составляет около 70% (+ / – 10%), D5,<strong> На рисунке 1 и В</strong>.</p><p class="jove_content"> На вторичном MLR на 5-й день, Ф. П. пролиферация аллогенных клеток из alloanergized РВМС, как правило, 10-15% (+ / – 10%), которое наблюдалось с управлением РВМС эквивалентно означает торможение распространения 85-90% (+ / – 10 %),<strong> Рисунок 2А и В</strong>. Это показывает, что alloanergized РВМС являются hyporesponsive к FP allostimulators.</p><p class="jove_content"> В отличие alloanergized РВМС обычно сохраняют 70-100% от их распространения на митогены (CD3/CD28 антитела), Т. П. allostimulators и ЦМВ лизат (в ЦМВ-реактивного доноров). Это показывает, что hyporesponsiveness из alloanergized РВМС специфичен для FP alloantigens.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Рисунок 1. А.</strong> Распространение (определяется тимидина) в первичной Смешанная реакция лимфоцитов использованием несоответствие HLA-стимулятор и ответчик мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) в отсутствии или наличии костимуляторных блокады использованием гуманизированные моноклональные анти-B7.1 и-В7.2 антител. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) в течение 8 представителя экспериментов с использованием уникального стимулятора-ответчик пар.<strong> B</strong>. Процент ингибирования пролиферация аллогенных клеток в первичных реактивный миномет осуществляется в присутствии костимуляторных блокады использованием гуманизированные моноклональные анти-B7.1 и В7.2-антител. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) для тех же 8 уникальных стимулятор-ответчик пар, изображенный на рис 1А.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Рисунок 2. А.</strong> Распространение (определяется тимидина) в средних реактивный миномет, где ответчик РВМС из первичных реактивный миномет осуществляется в отсутствие (контроль РВМС) или наличие костимуляторных блокады (alloanergized РВМС) являются restimulated с облученным первой стимуляторы стороны. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) для 8 уникальных стимулятор-ответчик пары изображены на рисунке 1.<strong> B</strong>. Процент ингибирования Первая партия пролиферация аллогенных клеток в средней реактивный миномет, где ответчик РВМС из первичных реактивный миномет осуществляется в отсутствие (контроль РВМС) или наличие костимуляторных блокады (alloanergized РВМС) являются restimulated с облученным первый стимуляторы стороны. Результаты представлены как среднее (+ /-SD) для 8 уникальных стимулятор-ответчик пары изображены на рисунках 1 и 2А.</p>