Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

1. Elemente, die Be Prepared bevor Sie fortfahren to Cell Plating Need: Entsprechende Volumen der kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet. Ein Aliquot NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine ist aufgetaut. Das Medium wird in einem 37 ° C Wasserbad erwärmt. Stammlösungen von epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) in einer Konzentration von 10 ug / ml und Heparin bei 0,2% voraus sind vorbereitet. Je nach Experiment Größe, sind mehrere 35-mm-Gewebe-Kulturschalen auf den Teller der Zellen und einer 150-200cm Kunststoff-Petrischale ist auch nötig, um die doppelte 35mm Gerichte halten und eine dritte 35-mm-Schale für Wasser benötigt. 2. Cell Preparation: Abhängig von Ihrem Experiment, können die Zellen von einem erwachsenen und embryonalen Quelle (primäre dissoziierten Gewebe oder dissoziiert Neurosphären) hergestellt werden. Dissect Gewebe von Erwachsenen / embryonalen Maus des zentralen Nervensystems (ZNS) oder distanzieren Erwachsene / embryonaler-derived Neurosphären nach wie vor 1,2 und dann beschrieben: Die einzigen Zellsuspension durch ein 40-um-size-Sieb-Filter geleitet wird, um so zu entfernen, nicht getrennten Klumpen. 10 &mgr; l der Zellsuspension mit 90μl des Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt. Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können auch verwendet werden. Bei der Verwendung von primären embryonalen oder adulten abgeleitete neurale Zellen, verdünnte die Zellsuspension auf eine Konzentration von 6,5 x 10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium. Bei der Verwendung von Zellen aus dissoziierten Neurosphären aus adulten oder embryonalen neuronalen Zellen abgeleitet, verdünnte die Zellsuspension auf eine Konzentration von 2,2 x 10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium. 3. Plating Cells in Halbfeste N-EUFA Medium: Das entsprechende Volumen aus den folgenden Komponenten in Ordnung ist gemischt, je nach Anzahl der Wiederholungen. Hier mischen wir den Betrag für zwei Bedarf repliziert oder doppelte Gerichte. Weitere Zahlen der Wiederholungen, siehe Tabelle 1. 1,7 ml NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine 330 ul der NeuroCult NSC Proliferation Supplements 6,6 ul des EGF (10μg/mL) 32 ul von Penicillin / Streptomycin 3,3 ul der b-FGF (10μg/mL) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. 3,3 ul von Heparin (0,2%) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. 25 &mgr; l der Zellsuspension (von 2,2 x 10 5 Zellen / ml Zellen aus dissoziierten Neurosphären oder 6,5 x 10 5 Zellen / ml primären Zellen aus dissoziierten ZNS-Gewebe). Hinweis: Die endgültige Anzahl der Zellen überzogen sollte etwa 2500 Zellen pro 35 mm Kulturschale werden für Neurosphäre abgeleiteten Zellen und 7500 Zellen pro 35 mm Kulturschale für Primärzellen. In einigen Fällen hat die letzte Zelle Plattierungsdichte auf, indem Sie eine Zelle Titration eingestellt werden. 150 Kolonien – Für statistische Analysen sollten die Gesamtzahl der Kolonien nach 21 Tagen der Kultur erkannt im Bereich von mindestens 50 sein. Das Medium mit den Zellen ist sanft und dann 1,3 ml kaltem Collagen-Lösung zur Zellsuspension übertragen und auch durch vorsichtiges Pipettieren gemischt, um zu vermeiden Einführung von Luftblasen gemischt. Die gemischte Lösung wird in die Mitte eines jeden 35mm Kulturschale (~ 1,5 ml / Schale) verzichtet und die Gerichte sind kippte vorsichtig mit kreisenden Bewegungen, damit die Mischung gleichmäßig verteilt über die Oberfläche der Schale. . Die doppelte 35 mm Kulturschalen werden in eine 100 mm Petrischale gelegt. Der Deckel des neuen 35 mm Schale wird entfernt und die offene Schale ist auch in der gleichen 100 mm Petrischale. Sterilem Wasser ist zu dieser offenen 35 mm Schale zugegeben, um eine optimale Luftfeuchtigkeit während der Inkubationszeit zu halten. Platz Bioassay-Platten (245 mm) verwendet werden, wenn mehr replizieren 35 mm Gerichte eingerichtet wurden. Auch hier sind 2 oder 3 offen 35 mm Schalen mit sterilem Wasser. Die Platten sind in einen Inkubator gesetzt bei 37 übertragen ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Das Kollagen gerinnt durch steigende Temperatur und Gelbildung wird innerhalb etwa einer Stunde auftreten. Die Kulturen sind während dieser Zeit nicht gestört werden. Kultivierte Zellen werden für 21 Tage (Unterschiede in Koloniegröße deutlich nach 21 Tagen zu unterscheiden) inkubiert. 4. Vorbereitung Replenishment Medium und Fütterung der Kultur: Als N-EUFA Kulturen über einen längeren Zeitraum (21 Tage) bebrütet werden, sollten Kulturen mit den entsprechenden vollständigen NeuroCult zugeführt werden Nachschub Medium frisch zubereitet wie folgt: 4,5 ml NeuroCult NSC Basal Medium mit 0,5 m gemischtL von NeuroCult NSC Proliferation Supplements und dann die Wachstumsfaktoren wird angefügt: 250 ul 10μg/mL EGF (bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml EGF zu geben) 125 ul 10μg/mL b-FGF (bis zu einer Endkonzentration von 0.25μg/mL b-FGF geben) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. 125 ul 0,2% Heparin, nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. 60 ul der entsprechenden vollständigen NeuroCult Replenishment Medium (für embryonale oder adulte Zellen) in der Mitte jedes NCFC Assay Schüssel einmal alle 7 Tage während der gesamten NCFC Assay Kultur Inkubation (21 Tage) aufgenommen. 5. Scoring N-CFC-Assay Derived Kolonien und Berechnung der Häufigkeit der Bona-fide-NSCs und neuronale Vorläuferzellen: Jede 35 mm Kulturschale befindet sich auf einem gerasterten Scoring Schale mit dem Rastermaß von 2,0 mm x 2,0 mm gelegt und dann beide Gerichte werden auf dem Mikroskoptisch platziert. Mit Low-Power-(2.5x – 5x) Objektiv, jedes Gericht wird gescannt und die Kolonien sind aufgrund ihrer Größe erzielt. Die Kolonien sind in zwei große Kategorien eingeteilt: Weniger als 2 mm Durchmesser ≥ 2 mm Durchmesser 6. Repräsentative Ergebnisse: Wie in Neurosphäre Test starten Zellen in N-CFC-Assay vernickelt sich zu vermehren und bilden kleine Kolonien von Zellen innerhalb von 3 bis 7 Tage nach dem Ausplattieren (Abbildung 1). In zwei Wochen kann Kolonien unterschiedlicher Größe unterschieden werden. Während die Mehrheit der Kolonien wachsen zu stoppen nach 14 Tagen neigen, weiterhin einige Kolonien an Größe zunehmen. Am Tag 21, Kolonien in einer der vier Kategorien eingeteilt werden: 1) weniger als 0,5 mm Durchmesser, 2) von 0,5 bis 1 mm Durchmesser, 3) 1 bis 2 mm Durchmesser und 4) ≥ 2mm im Durchmesser. Praktisch werden die Kolonien kleiner als 2 mm Durchmesser bezeichnet als Stammvater abgeleitet (Abbildung 2) und Kolonien ≥ 2mm im Durchmesser sind, bezeichnet als NSC abgeleitet (Abbildung 3). Die Anzahl der Kolonien ≥ 2mm im Durchmesser pro insgesamt Zellen ausplattiert, stellt die Häufigkeit der tatsächlichen bona fide neurale Stammzellen mit langfristiger Selbst-Erneuerung und Multi-Potential-Funktionen. Die gesamte Neurosphäre bilden Frequenz in einer bestimmten Zellpopulation nach 7-8 Tag in einem parallel NSA Experiment wurde geschätzt, ähnlich zu sein, die gesamte Kolonie bildende Frequenz der gleichen Zellpopulation nach 21 Tagen in einem N-EUFA Experiment. Die N-EUFA bietet jedoch eine weniger restriktive Bedingungen, so dass jede Zelle kann ihre volle proliferative Potenzial zu zeigen. Komponente 2 Wiederholungen 3 Wiederholungen 4 Wiederholungen NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine 1700 2550 3400 NeuroCult NSC Proliferation Supplements 330 495 660 EGF (10 ug / mL) 6,6 9,9 13,2 bFGF (10 ug / mL), nur für erwachsene Zellen 3,3 4,95 6,6 Heparin-Lösung (0,2%), nur für erwachsene Zellen 3,3 4,95 6,6 Penicillin / Streptomycin (1:100) 32 48 64 Cells unter: 2,2 x 10 5 kultivierten Zellen / ml oder 6,5 x 10 5 primären Zellen / ml 25 37,5 50 Kollagenlösung 1300 1950 2600 Tabelle 1. Komponenten einer kompletten N-CFC-Assay Kultur. Abbildung 1. Representative Kolonien in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 7 Tage nach dem Ausplattieren. Die Kolonien zeigt möglicherweise unterschiedlicher Morphologie und Größe. Original-Vergrößerung; 4x Abbildung 2. Representative Vorläuferzellen abgeleitet Kolonien unterschiedlicher Größe in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 21 Tage nach dem Ausplattieren. Wie gezeigt, haben die Kolonien unterschiedlicher Morphologie, aber alle sind weniger 2 mm groß. Original-Vergrößerung; 4x Abbildung 3. Representative bona fide Stammzellen abgeleitete Kolonie in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 21 Tage nach dem Ausplattieren. Aus embryonalen Stammzellen Kolonien zeigt möglicherweise unterschiedliche Morphologie (siehedas video), aber alle sind ≥ 2mm im Durchmesser. Original-Vergrößerung; 4x