세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

1. 전지 도금을하기 전에 준비를해야 항목 : 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다. 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 – 무료 매체의 나누어지는가 해동됩니다. 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다. 표피 성장 인자 (EGF), 10 μg / 0.2 %에서 ML과 헤파린의 농도에서 기본 fibroblastic 성장 인자 (B – FGF)의 주식 솔루션은 미리 준비가되어 있습니다. 실험의 크기에 따라 여러 35mm 조직 문화 요리 판 세포 하나 150-200cm 플라스틱 페트리 접시도 중복 35mm 요리를 개최하는 데 필요한 물을 위해 제 3 35mm 접시 필요합니다. 2. 셀 준비 : 실험에 따라 세포는 성인이나 배아 소스 (주 dissociated 조직 또는 dissociated neurospheres)에서 준비하실 수 있습니다. 성인 / 마우스 배아 중추 신경계 (CNS)에서 조직을 해부하다 또는 다음 1,2 앞에 설명한 배아 – 유래 / 성인 neurospheres을 떼어 놓다 : 단일 세포 현탁액은 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 전달되도록 같은 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거합니다. 세포 현탁액의 10μl는 셀 카운트를 수행하는 Trypan 파랑의 90μl와 혼합됩니다 참고 :. 기타 적절한 세포 dilutions도 사용할 수 있습니다. 기본 배아 또는 성인 파생된 신경 세포를 사용하는 경우, 전체 NSC 매체 6.5 X 10 5 세포 / ML의 농도로 세포 현탁액을 희석. 성인이나 배아 신경 세포에서 파생된 dissociated neurospheres의 세포를 사용하는 경우, 전체 NSC 매체에서 2.2 × 10 5 세포 / ML의 농도로 세포 현탁액을 희석. 3. 세미 솔리드 N – CFCA 매체에 도금 셀 : 다음과 같은 구성 요소의 적절한 볼륨 복제의 숫자에 따라 순서에 혼합됩니다. 여기 복제 두 필요한 금액을 혼합하거나 요리를 중복. 복제의 추가 숫자, 표 1을 참조하십시오. 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 – 무료 매체의 1.7 ML NeuroCult NSC 확산 보조 식품의 330 μL EGF의 6.6 μL (10μg/mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신의 32 μL B – FGF (10μg/mL)의 3.3 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. 헤파린 (0.2 %)의 3.3 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. 세포 현탁액의 25μL (dissociated neurospheres 또는 6.5 X 10 5 셀 / dissociated CNS 조직에서 ML 기본 세포에서 2.2 X 10 5 셀 / ML 세포) 참고 :. 도금 최종 셀 번호는 35mm 문화 요리 당 2500에 대한 셀해야합니다 neurosphere 파생된 세포 및 기본 세포 35mm 문화 요리 당 7,500 전지. 어떤 경우에는, 최종 세포 도금 밀도는 셀 적정 실험을 수행하여 조정되어야한다. 150 식민지 – 통계 분석을 위해, 문화, 21 일 후에 감지된 식민지의 총 개수는 적어도 50의 범위 내에서하여야한다. 세포를 포함하는 매체는 추운 콜라겐 솔루션의 1.3 ML이 세포 현탁액에 전송하고 거품을 도입 피하기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 혼합됩니다 부드럽게 그리고 혼합이다. 혼합 솔루션은 각각 35mm 문화 요리 (~ 1.5 ML / 요리)의 중심에 적절하고 요리는 부드럽게 혼합이 접시의 표면 위에 균일하게 분산하도록 원형 운동을 사용하여 밀고있다. . 중복 35mm 문화 요리는 100mm 페트리 접시에 게재됩니다. 새로운 35mm 요리의 뚜껑을 제거하고 열려있는 요리도 동일한 100mm 페트리 접시에 배치됩니다. 멸균 물이 부화 기간 동안 최적의 습도를 유지하기 위해이 열려 35mm 요리에 추가됩니다. 스퀘어 bioassay 판 (245mm)가 더 많은 복제 35mm 요리가 설정되었을 때 사용됩니다. 다시, 2 또는 멸균 물이 들어있는 3 열 35mm 요리를 포함합니다. 번호판이 37 보육 세트에 전송 ° C 5 % CO2와 95 %의 습도. 증가 온도 및 겔 형성하여 콜라겐 확대해는 약 한 시간 이내 발생합니다. 문화는이 시간 동안 방해해서는 안됩니다. 교양 세포 21일 (식민지의 크기의 차이가 명확하게 21일 후 구분할 수)에 incubated 수 있습니다. 4. 보충 매체를 준비하고 문화를 먹이 : N – CFCA 문화는 시간 (21 일)의 기간 동안 incubated이므로, 문화는 적절한 전체 NeuroCult와 공급한다 보충 매체는 다음과 같이 신선한 준비 : NeuroCult NSC 기초 중형 4.5 ML은 0.5 m로 혼합NeuroCult NSC 확산 보조 식품 후 성장 요인 L이 추가됩니다 10μg/mL EGF 250 μL (0.5 μg / ML EGF의 최종 농도를 제공) 10μg/mL B – FGF (0.25μg/mL B – FGF의 최종 농도를 주다) 125 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. 0.2 % 헤파린 125 μL은 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. 적절한 전체 NeuroCult의 보충 매체 (배아 또는 성인 전지)의 60 μL가 전체 NCFC 분석 문화 보육 (21 일) 동안 매 7 일마다 한 각 NCFC 분석 접시의 중앙에 추가됩니다. 5. N – CFC 분석 유래 식민지를 채점하고 타고난 NSCs 및 신경 전구 세포의 빈도를 계산 : 각 35mm 문화 요리는 2.0 mm X 2.0 mm의 격자 크기 gridded 점수 요리에 위치하고 양쪽 요리는 현미경 스테이지에 표시됩니다. 객관 렌즈, 각각의 요리가 스캔되고 식민지가 자신의 크기에 따라 점수 아르 – 낮은 전력을 (배 2.5X)를 사용. 식민지는 두 가지 주요 범주로 분류됩니다 : 이하 2mm 직경 ≥ 2mm 직경 6. 대표 결과 : 칠일 도금 후 (그림 1) – neurosphere 분석에서와 마찬가지로, N – CFC 분석에 도금 세포 3 이내에 세포의 작은 식민지를 분아 따위에 의해 번식하고되기 시작한다. 2 주 시간에서 다양한 크기의 식민지가 구별하실 수 있습니다. 식민지의 대부분의 14 일 후에 성장을 중지하는 경향이 있지만, 일부 식민지는 크기가 증가되고 있습니다. 1mm 직경, 3) 1 – – 2mm 직경 4) ≥ 2mm 직경 미만 0.5 mm 직경, 2) 0.5 1) : 일 21에 의해 식민지는 4 가지 범주 중 하나에 분류 될 수 있습니다. 실제로, 시조가 파생된로 2mm 직경보다 작은 식민지가라고합니다 (그림 2)와 NSC는 (그림 3)과 같은 파생 식민지는 직경 ≥ 2mm가라고합니다. 도금 총 세포마다 직경 식민지 ≥ 2mm의 숫자는, 장기적인 자기 갱신과 다중 잠재적인 기능을 갖춘 실제 타고난 신경 줄기 세포의 빈도를 나타냅니다. 병렬 NSA 실험에서 7~8일 후 특정 세포 인구의 주파수를 형성 총 neurosphere은 N – CFCA 실험 21 일 후 같은 세포 인구의 주파수를 형성 전체 식민지와 유사한 것으로 추산되었습니다. N – CFCA 그러나, 각 세포는 전체 proliferative 가능성을 보여 줄 수 있도록 같은 더 허용 조건을 제공합니다. 구성 요소 2 복제 3 복제 4 복제 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 – 무료 중간 1700 2550 3400 NeuroCult NSC 확산 보조 식품 330 495 660 EGF (10 μg / ML) 6.6 9.9 13.2 성인용 전지 bFGF (10 μg / ML) 3.3 4.95 6.6 성인용 세포에 대한 헤파린 솔루션 (0.2 %), 3.3 4.95 6.6 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1:100) 32 48 64 :에서 셀 2.2 X 10 5 교양 세포 / ML 또는 6.5 X 10 5 일차 전지 / ML 25 37.5 50 콜라겐 솔루션 1300 1950 2600 표 1. 완벽한 N – CFC 분석 문화의 구성 요소. 1. 통로 하나 E14 마우스 NSCs의 N – CFCA 문화의 대표 식민지 칠일 도금 후 그림. 식민지 다른 형태와 크기를 표시 수도 있습니다. 원본 확대, 4X 그림 2. 통과 N – CFCA 문화에서 다른 크기 21일 도금 후에도 E14 마우스 NSCs 대표 시조 파생 식민지. 그림과 같이, 식민지는 다른 형태가 있지만 모든 크기가 적은 2mm입니다. 원본 확대, 4X 그림 3. 대표 타고난 줄기 세포는 21일 도금 후 통과 한 E14 마우스 NSCs을의 N – CFCA 문화 식민지를 파생. 줄기 세포 유래 식민지는 (보고 서로 다른 형태를 표시할 수 있습니다비디오)하지만, 모두가 직경 ≥ 2mm입니다. 원본 확대, 4X