iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

1. UV cross-linking של תאים בתרבית רקמה הסר את המדיה ולהוסיף 6 מ"ל קר כקרח PBS לתאים הגדלים צלחת 10 ס"מ (מספיק בשביל שלושה ניסויים). הסר את המכסה ומניחים על קרח. מקרינים פעם עם 150 mJ / 2 ס"מ על 254 ננומטר. קציר התאים על ידי גירוד עם מרים תא. העברת 2 מ"ל ההשעיה תא אחד של שלושה microtubes. ספין במהירות שיא עבור 10 שניות ב 4 ° C לתאי גלולה, ולאחר מכן להסיר supernatant. Snap-להקפיא את כדורי התא על הקרח חנות יבש ב -80 ° C עד השימוש. 2. ביד הכנה הוסף 100 μl של חלבון Dynabeads (Dynal, 100.02) עבור ניסוי microtube טרי (השתמש Dynabeads חלבון G עבור עכבר או נוגדנים עז). לשטוף עם חרוזים 2x חיץ תמוגה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, deoxycholate נתרן 0.5%, 1 / 100 מעכבי פרוטאז קוקטייל השלישי, Calbiochem). Resuspend חרוזים במאגר 100 תמוגה μl עם נוגדן 20-10 מיקרוגרם. סובב צינורות בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות. לשטוף 3x עם חיץ 900 תמוגה μl ולהשאיר בכביסה האחרונה עד מוכנים לשלב 4.1. 3. תא תמוגה חלקי מערכת העיכול RNA Resuspend התא גלולה במאגר 1 מ"ל תמוגה ולהעביר microtubes 1.5 מ"ל. הכן דילול 1 / 500 של RNase אני (Ambion, AM2295). הוסף 10 μl דילול RNase אני, כמו גם 2 DNase טורבו μl lysate אל התא (1 / 500 RNase דילולים אני [נמוך RNase] משמשים להכנת ספריה, 1 / 50 דילולים [גבוה RNase] יש צורך לשלוט על סגוליות נוגדן) . דגירה דגימות 3 דקות בדיוק בשעה 37 ° C, רועד בסל"ד 1100. מיד להעביר קרח. ספין על 4 ° C ו 22,000 g עבור 20 דקות כדי לנקות את lysate. בזהירות לאסוף את supernatant (להשאיר על 50 lysate μl עם גלולה). 4. Immunoprecipitation הסר את חוצץ לשטוף מן חרוזים (משלב 2.5), ואז להוסיף את lysate תא (משלב 3.4). סובב את דגימות עבור 2 שעות על 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 2x עם חיץ 900 μl מלח גבוהה (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 1 M NaCl: 1 mM EDTA; 1% NP-40, 0.1% SDS, נתרן deoxycholate 0.5%). לשטוף עם 2x חיץ 900 לשטוף μl (20 mM טריס-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl 2; 0.2% Tween-20). 5. Dephosphorylation של רנ"א 3'ends בטל supernatant ו resuspend החרוזים בתמהיל 20 PNK μl (15 μl מים; 4 pH μl 5x PNK 6.5 חיץ [350mMTris-HCl, pH 6.5, 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2]; 0.5 μl אנזים PNK; 0.5 μl RNasin [Promega]). דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C. הוסף 500 μl חיץ לרחוץ ולשטוף 1x עם חיץ גבוה מלח. לשטוף עם 2x חיץ לשטוף. 6. קשירת Linker ל RNA הקצוות "3 הסר בזהירות את supernatant ו resuspend החרוזים בתמהיל קשירת μl 20 (9 μl מים; 4 קשירת μl חיץ 4x [200 mMTris-HCl: MM 40m gCl 2; 40 dithiothreitol mM]; 1 μl RNA האנזים [חוד]; 0.5 RNasin μl [Promega]; 1.5 מקשר μl מראש adenylated L3 [20 מיקרומטר]; 4 μl PEG400 [81170, סיגמא]). דגירה לילה בשעה 16 ° C. הוסף 500 μl חיץ לשטוף ולאחר מכן לשטוף עם 2x חיץ גבוה מלח 1 מ"ל. לשטוף עם 2x חיץ מ"ל 1 לרחוץ לעזוב מ"ל 1 של לשטוף את השני. 7. סוף תיוג RNA 5 " הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים μl 8 תמהיל PNK חם (0.4 μl PNK [חוד]; 0.8 μl 32 P-γ-ATP; 0.8 חיץ μl 10x PNK [חוד]; 6 מים μl). דגירה של 5 דק 'ב 37 ° C. מוציאים את תערובת PNK חם resuspend את החרוזים 20 Nupage μl חיץ 1x העמסה (Invitrogen). לדגור על thermomixer ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מיד מקום על מגנט כדי לזרז את החרוזים ריק לטעון את supernatant על הג'ל (ראה שלב 8). 8. SDS-PAGE והעברת הממברנה טען את דגימות על NuPAGE 4-12% Bis-טריס ג'ל (Invitrogen) על פי הוראות היצרן. אני השתמש 0.5 של 1x מגבים לרוץ חיץ (Invitrogen). גם עומס של 5 μl סמן טרום מוכתמים בחלבון גודל (למשל PAGE שליט פלוס, Fermentas, SM1811). הפעל את ג'ל 50 דקות ב 180 V. הסר את חזית ג'ל וזורקים כמו פסולת מוצקה (מכיל חופשי רדיואקטיבי ATP). מעבירים את חלבון-RNA מתחמי מן הג'ל על קרום nitrocellulose באמצעות מנגנון העברת Novex רטוב על פי הוראות היצרן (Invitrogen, העברת 1 h ב V 30). לאחר ההעברה, יש לשטוף את הממברנה במאגר PBS, אז לעטוף אותו בפלסטיק נצמד ולחשוף אותו סרט פוג'י ב -80 ° C (מקום מדבקה ניאון ליד הממברנה כדי ליישר לא מאוחרהוא סרט הממברנה; לבצע חשיפות של 30 דקות, 1h ומעלה בלילה). 9. בידוד RNA לבודד את חלבון-RNA מתחמי מניסוי נמוכה RNase באמצעות autoradiograph משלב 8.5 כמסיכה. חותכים את הקטע הזה של קרום לפרוסות קטנות כמה ולמקם אותם לתוך microtube 1.5 מ"ל. הוסף 200 μl חיץ קי (100 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) וכן 10 μl proteinase K (רוש, 03115828001) את פיסות קרום. דגירה רועד בסל"ד 1100 עבור 20 דקות בשעה 37 ° C. הוסף 200 μl של PKurea חיץ (100 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M אוריאה) ו דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C. איסוף הפתרון ולהוסיף אותו יחד עם 400 μl של רנ"א פנול / כלורופורם (Ambion, 9722) עד שלב 2 צינור מ"ל ג'ל נעל כבדה (713-2536, VWR). דגירה של 5 דקות בקצב של 30 ° C, רועד בסל"ד 1100. הפרד את השלבים על ידי ספינינג במשך 5 דקות ב 13,000 סל"ד בטמפרטורת החדר. מעבירים את השכבה המימית לתוך צינור חדש (להיזהר שלא לגעת בג'ל עם פיפטה). הוספת 0.5 μl glycoblue (Ambion, 9510) ו 40 אצטט μl 3 M נתרן pH 5.5 ומערבבים. לאחר מכן להוסיף 1 מ"ל אתנול 100%, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C. 10. הפוך שעתוק ספין של 20 דקות ב 15,000 סל"ד ו – 4 ° C. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 0.5 מ"ל אתנול 80%. Resuspend את הכדור ב 7.25-RNA μl / תערובת פריימר (6.25 μl מים; 0.5 פריימר Rclip μl [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP לערבב [10mm]). עבור כל ניסוי או לשכפל, להשתמש פריימר Rclip שונה המכיל רצפים ברקוד אישי (ראה 14). דגירה של 5 דקות ב 70 מעלות צלזיוס לפני קירור עד 25 ° C. הוסף μl 2.75 RT לערבב (2 חיץ μl 5x RT; 0.5 μl 0.1M DTT: 0.25 μl כתב עילי III הפוך transcriptase [Invitrogen]). דגירה 5 דקות במהירות של 25 ° C, 20 דקות בשעה 42 ° C, 40 דקות בשעה 50 ° C ו 5 דק 'ב 80 ° C לפני קירור 4 ° C. הוסף 90 μl TE חיץ, 0.5 glycoblue μl ו 10 נתרן אצטט μl pH 5.5 ומערבבים. ואז להוסיף 250% אתנול 100 μl, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C. 11. ג'ל טיהור cDNA ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend את כדורי ב μl 6 של מים. הוסף חוצץ 6 μl 2x TBE-אוריאה וטעינה (Invitrogen). דגימות חום עד 80 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ישירות לפני הטעינה. טען את הדגימות על הג'ל 6% TBE-אוריאה precast (Invitrogen) ולרוץ 40 דקות ב 180 V כפי שתואר על ידי היצרן. גם לטעון סמן נמוך משקל מולקולרי לחיתוך הבאים (ראה להלן). גזור שלוש להקות ב 120-200 NT (גבוהה), 85-120 NT (בינוני) ו 70-85 NT (נמוך). השתמש theupper לצבוע את הסימנים על התמיכה ג'ל פלסטיק מדריך כריתה (ראה איור 3). שים לב כי תחל Rclip ואת רצף L3 ביחד מהווים NT 52 של רצף CLIP. הוסף 400 μl TE ולרסק את הפרוסה ג'ל לחתיכות קטנות באמצעות הבוכנה 1 מ"ל במזרק. דגירה רועד בסל"ד 1100 למשך 2 שעות ב 37 ° C. מניחים שתי 1 כוס ס"מ טרום מסננים (Whatman, 1823010) לתוך עמודה שחקן המשנה SpinX (Corning Incorporated, 8161). מעבירים את החלק הנוזלי של המדגם לעמודה. ספין דקות 1 ב 13,000 סל"ד לתוך צינור 1.5 מ"ל. הוספת 0.5 μl glycoblue ו 40 נתרן אצטט μl pH 5.5, ואז לערבב את המדגם. הוסף 1 מ"ל אתנול 100%, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C. 12. קשירת של פריימר על 5'end של cDNA ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend את כדורי בתמהיל 8 קשירת μl (6.5 μl מים; 0.8 μl 10x CircLigase הצפת השנייה; 0.4 μl 50 מ"מ MnCl 2; 0.3 μl; Circligase II [Epicentre]) ו דגירה עבור h 1 ב 60 ° C. הוסף 30 μl לערבב אוליגו חישול (26 μl מים; 3 הצפת FastDigest μl [Fermentas]; 1 μl cut_oligo [10 מיקרומטר]). דגירה דקות 1 ב 95 ° C. ואז להקטין את הטמפרטורה כל 20 שניות עד 1 ° C עד 25 ° C הם הגיעו. הוסף 2 BamHI μl (Fermentas מהיר) ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C. הוסף 50 μl TE ו 0.5 glycoblue לערבב μl ו. הוסף 10 μl נתרן אצטט pH 5.5 ומערבבים, ואז מוסיפים 250 μl 100% אתנול. מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C. 13. PCR הגברה ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend גלולה במים 19 μl. מכינים את תערובת ה-PCR (19 μl cDNA: 1 μl תערובת פריימר P5/P3 solexa, 10 מיקרומטר אחד; 20 Accuprime μl Supermix האנזים 1 [Invitrogen]). הפעל את התוכנית הבאה PCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דק ', [94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 68 ° C למשך 30 שניות] 25-35 מחזורים, 68 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 4 ° C לנצח. מיקס 8 μl מוצר PCR עם 2 μl של חיץ טעינת 5x TBE עומס על ג'ל 6% TBE precast (Invitרוגן). הכתם ג'ל עם Sybrgreen אני (Invitrogen) ולנתח עם imager ג'ל. ברקוד על primers Rclip מאפשרים דגימות זמנית שונה לפני הגשת עבור סידור תפוקה גבוהה. שלח 15 μl של הספרייה עבור סידור ולאחסן את כל השאר. 14. לינקר ו פריימר רצפים הדנ"א מקשר טרום adenylated 3 ': [אנחנו מזמינים את מתאם ה-DNA מן IDT ולאחר מכן לבצע aliquots של 20μM.] 15. נציג תוצאות: לפני רצף של הספרייה iCLIP, ההצלחה של הניסוי ניתן לפקח על שני שלבים: autoradiograph של מורכבות חלבון-RNA לאחר העברת קרום (שלב 8.5) ואת התמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR (צעד 13.4). ב autoradiograph של הדגימות נמוך RNase, רדיואקטיביות מפוזר יש לראות מעל המשקל המולקולרי של החלבון (איור 2, מדגם 4). ל-high-RNase דגימות, רדיואקטיביות זו מתמקדת יותר משקל מולקולרי של החלבון (איור 2, מדגם 3). כאשר אין נוגדנים משמש immunoprecipitation, אות לא צריך להיות מזוהה (איור 2, דוגמאות 1 ו -2). שולט חשוב נוסף עבור הספציפיות של immunoprecipitation או להשמיט קרינה UV או להשתמש בתאים שאינם מבטאים את החלבון של עניין 14. התמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR (צעד 13.4) צריך להראות מגוון בגודל המתאים השבר cDNA (גבוהה, בינונית או נמוכה) מטוהרים בשלב 11.4 (איור 4, נתיבי 4-6). שים לב primers PCR P3Solexa ו P5Solexa להציג nt נוסף 76 לגודל של cDNA. אם אין נוגדנים משמש במהלך immunoprecipitation, המוצרים המתאימים PCR לא צריך להיות מזוהה (איור 4, נתיבי 1-3). דימר המוצר פריימר יכול להופיע על 140 nt. לקבלת תוצאות נציג רצף תפוקה גבוהה ומנתח bioinformatic הבאים לראות 14. באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול iCLIP. חלבון-RNA הם קומפלקסים קוולנטית צולבים in vivo באמצעות קרינת UV (שלב 1). החלבון של הריבית מטוהרים יחד עם RNA כבול (שלבים 2-5). כדי לאפשר תחול רצף ספציפי של שעתוק לאחור, מתאם RNA הוא ligated ל 3 "בסופו של רנ"א, בעוד 5 'סוף מסומן רדיואקטיבית (שלבים 6 ו 7). צולבים חלבון-RNA מתחמי הם מטוהרים מ-RNA בחינם באמצעות SDS-PAGE והעברת הממברנה (שלב 8). RNA הוא התאושש הממברנה על ידי לעכל את החלבון עם proteinase K להשאיר פוליפפטיד הנותרים בקישור הנגדית נוקלאוטיד (שלב 9). שעתוק הפוך (RT) חותכת את פוליפפטיד הנותרים ומציג שני אזורים מתאם cleavable רצפים ברקוד (שלב 10). בחירת גודל מסיר חינם פריימר RT לפני circularization. לינאריזציה הבאים מייצר תבניות מתאים הגברה PCR (שלבים 11-15). לבסוף, תפוקה גבוהה יוצרת רצף קורא בו רצפי ברקוד הם מיד אחריו נוקלאוטיד האחרון של cDNA (שלב 16). מאז זה בתנוחה אחת מאתרת נוקלאוטיד במעלה הזרם של צולבים נוקלאוטיד, האתר מחייב ניתן להסיק עם רזולוציה גבוהה. איור 2. Autoradiograph של צולבים hnRNP C-RNA מתחמי באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing והעברת הממברנה. hnRNP C-RNA מתחמי היו חיסונית מטוהרים מן תמציות התא באמצעות נוגדן כנגד hnRNP C (α hnRNP C, דגימות 3 ו 4). RNA היה מעוכל חלקית באמצעות נמוך (+) או גבוה (+ +) ריכוז של RNase. מתחמי הסטה כלפי מעלה מ גודל של חלבון (40 KDA) ניתן להבחין (מדגם 4). השינוי בולטת פחות כאשר ריכוזים גבוהים של RNase שימשו (מדגם 3). האות רדיואקטיבי נעלמת כאשר אין נוגדן שימש immunoprecipitation (דוגמאות 1 ו -2). איור 3. 6% סכמטי TBE-אוריאה ג'ל (Invitrogen) להנחות את כריתה של מוצרים iCLIP cDNA. הג'ל הוא לרוץ 40 דק 'ב 180 V המוביל דפוס הגירה לשחזור של cDNAs וצבעים (אור כחול כהה) בתוך הג'ל. השתמש סכין גילוח לחתוך (קו אדום) הגבוהה (H), בינוני (M), נמוך (L) שברים cDNA. התחל על ידי חיתוך באמצע צבע כחול בהיר ומיד לעיל סימן על הקלטת ג'ל פלסטיק. מחלקים את השברים בינוני נמוך לקצץ את החלק היחסי הגבוה כ 1 ס"מ מעל צבע תכלת. השתמש חתכים אנכיים מונחה על ידי בכיסים ואת צבע להפריד בין נתיבים שונים (בדוגמה זו 1-4). השביל סמן (מ ') יכול להיות מוכתם צילמו לשלוטגודל לאחר חיתוך. גדלים שבר מסומנים בצד ימין. איור 4. ניתוח של ה-PCR-הגברה ספריות iCLIP cDNA באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. RNA התאושש הקרום (איור 1) היה עיבד הפוך גודל מטוהרים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing (איור 2). שלושה שברים בגודל של cDNA (גבוה [ח]: 120-200 nt, בינוני [ז]: 85-120 nt נמוך [יב]: 70-85 NT) נמצאו, circularized, מחדש לינארית ו-PCR מוגבר. מוצרי ה-PCR של התפלגות גודל שונים ניתן לראות כתוצאה של גדלים שונים של שברים קלט. מאז פריימר PCR מציג 76 NT ל cDNA, גדלים צריך לנוע בין 196-276 nt גבוהה, 161-196 NT עבור בינוני 146-161 NT עבור שברים גודל נמוך. מוצרי ה-PCR נעדרים כאשר אין נוגדן שימש immunoprecipitation (נתיבי 1-3).