iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

1. UV verknoping van weefselcultuurcellen Verwijder de media en voeg 6 ml ijskoude PBS aan cellen gekweekt in een 10 cm plaat (genoeg voor drie experimenten). Verwijder het deksel en plaats op ijs. Bestralen een keer met 150 mJ / cm 2 bij 254 nm. Oogst de cellen door schrapen met een cel lifter. Breng 2 ml celsuspensie aan elk van de drie microbuisjes. Draaien op topsnelheid voor 10 sec bij 4 ° C tot pellet cellen, verwijder supernatant. Snap-vries de cel pellets op droog ijs en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. 2. Bead voorbereiding Voeg 100 ul van proteïne A Dynabeads (Dynal, 100,02) per experiment een nieuwe microbuisjes (Gebruik proteïne G Dynabeads voor een muis of een geit antilichamen). Was kralen 2x met lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; 0,5% natriumdeoxycholaat; honderdste proteaseremmer cocktail III, Calbiochem). Resuspendeer kralen in 100 ul lysisbuffer met 2-10 ug antilichaam. Draai buizen bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten. Was 3x met 900 ul lysis buffer en laat in de laatste wasbeurt tot klaar om verder te gaan 4,1 stap. 3. Cellysis en gedeeltelijke RNA spijsvertering Resuspendeer de celpellet in 1 ml lysis buffer en transfer naar 1,5 ml microbuisjes. Bereid een 1 / 500 verdunning van RNase I (Ambion, AM2295). Voeg 10 pi RNase ik verwatering evenals 2 pi Turbo DNase de cel lysaat (1 / 500 RNase ik verdunningen [lage RNase] worden gebruikt voor bibliotheken voorbereiding; 1 / 50 verdunning [hoge RNase] nodig zijn om de controle voor de antilichaamspecificiteit) . Incubeer de monsters voor exact 3 min bij 37 ° C, schudden bij 1.100 tpm. Onmiddellijk over te dragen aan ijs. Spin bij 4 ° C en 22.000 g gedurende 20 minuten aan het lysaat te wissen. Zorgvuldig verzamelen supernatant (laat ongeveer 50 ui lysaat met de pellet). 4. Immunoprecipitatie Verwijder de wasbuffer van de kralen (uit stap 2.5) en voeg vervolgens de cel lysaat (vanaf stap 3.4). Draai de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de kralen 2x met 900 ul high-zout-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS; 0,5% natriumdeoxycholaat). Was 2x met 900 ul wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 0,2% Tween-20). 5. Defosforylatie van RNA 3'ends Verwijder het supernatant en resuspendeer de parels in 20 pl PNK mix (15 ul water; 4 il 5x PNK pH 6,5 buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK enzym; 0,5 ul RNasin [Promega]). Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Voeg 500 ul wasbuffer en was 1x met een hoge-zout buffer. Was 2x met wasbuffer. 6. Linker ligatie naar 3 'uiteinden RNA Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de parels in 20 pl ligatie mix (9 ul water; 4 pi 4x ligatiebuffer [200 mMTris-HCl; 40m MM GCL 2, 40 mM dithiothreitol]; een ul RNA-ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]). Incubeer overnacht bij 16 ° C. Voeg 500 ul wasbuffer en dan 2x wassen met 1 ml high-zout buffer. Was 2x met 1 ml wasbuffer en laat in 1 ml van het tweede wassen. 7. RNA 5 'uiteinde etikettering Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 8 pl van hot PNK mix (0,4 ul PNK [NEB]; 0,8 ul 32 P-γ-ATP; 0,8 pl 10x PNK buffer [NEB]; 6 ul water). Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. Verwijder de hete PNK mix en resuspendeer de parels in 20 pl 1x Nupage laadbuffer (Invitrogen). Incubeer op een Thermomixer bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Direct plaats op een magneet voor het neerslaan van de lege kralen en het supernatant belasting op de gel (zie stap 8). 8. SDS-PAGE en membraan overdracht Laad de monsters op een 4-12% NuPAGE Bis-Tris Gel (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 0,5 l 1x MOPS lopen buffer (Invitrogen). Ook laden 5 ul van een pre-gekleurde eiwit size marker (bijvoorbeeld PAGE heerser plus, Fermentas, SM1811). Laat de gel gedurende 50 minuten op 180 V. Verwijder de gel voor-en gooi als vast afval (bevat gratis radioactief ATP). Breng de eiwit-RNA-complexen van de gel tot een nitrocellulose membraan met behulp van de Novex natte overdracht inrichting volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, overdracht 1 uur bij 30 V). Na de overdracht, het membraan in PBS-buffer spoelen, dan wikkel het in Saran Wrap en blootstellen aan een Fuji film bij -80 ° C (plaats een fluorescerende sticker naast het membraan om later af te stemmen thij film en het membraan, uit te voeren blootstelling gedurende 30 minuten, 1 uur en 's nachts). 9. RNA-isolatie Isoleer de eiwit-RNA-complexen van de lage-RNase experiment met de autoradiogram uit stap 8.5 als een masker. Snijd dit stukje membraan in verschillende dunne plakjes en leg ze in een 1,5 ml microbuisjes. Voeg 200 ul PK buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) en 10 ul proteinase K (Roche, 03115828001) om het membraan stukken. Incubeer schudden bij 1100 rpm gedurende 20 min bij 37 ° C. Voeg 200 ul van PKurea buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M ureum) en voor 20 min bij 37 ° C. incubeer Verzamel de oplossing en voeg deze samen met 400 ul van RNA fenol / chloroform (Ambion, 9722) om een ​​2 ml Phase Lock Gel Heavy buis (713 tot 2536, VWR). Incubeer 5 min bij 30 ° C, schudden bij 1.100 tpm. Scheid de fasen door het draaien gedurende 5 minuten bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur. Breng de waterlaag in een nieuwe buis (pas op voor de gel contact met de pipet). Voeg 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) en 40 pi 3 M natriumacetaat pH 5,5 en meng. Voeg vervolgens 1 ml 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. 10. Reverse transcriptie Spin gedurende 20 min bij 15000 rpm en 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de pellet met 0,5 ml 80% ethanol. Resuspendeer de pellet in 7,25 ul RNA / primer mix (6,25 ul water; 0,5 ul Rclip primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP mix [10 mM]). Voor elk experiment of te repliceren, gebruik een andere Rclip primer met individuele barcode sequenties (zie 14). Incubeer 5 minuten bij 70 ° C te koelen tot 25 ° C. Voeg 2,75 ul RT mix (2 pi 5x RT buffer; 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III reverse transcriptase [Invitrogen]). Incubeer 5 min bij 25 ° C, 20 min bij 42 ° C, 40 min bij 50 ° C en 5 minuten bij 80 ° C te koelen tot 4 ° C. Voeg 90 ul TE-buffer, 0,5 ul glycoblue en 10 pl natriumacetaat pH 5,5 en meng. Voeg vervolgens 250 ul 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. 11. Gel zuivering van cDNA Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellets in 6 pi van water. Voeg 6 pl 2x TBE-ureum laadbuffer (Invitrogen). Warmte monsters tot 80 ° C gedurende 3 minuten direct voor het laden. Laad de monsters op een prefab 6% TBE-ureum gel (Invitrogen) en een looptijd van 40 minuten op 180 V, zoals beschreven door de fabrikant. Ook laden een laag moleculair gewicht marker voor latere snijden (zie hieronder). Snijd drie bands op 120 tot 200 nt (hoog), 85-120 nt (medium) en 70-85 nt (laag). Gebruik theupper kleurstof en de markeringen op de plastic gel steun aan excisie gids (zie figuur 3). Merk op dat de Rclip primer en de L3 volgorde zijn samen goed voor 52 nt van de CLIP-reeks. Voeg 400 ul TE en plet de gel plak in kleine stukjes met behulp van een 1 ml spuit zuiger. Incubeer schudden bij 1100 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. Plaats twee 1 cm glas pre-filters (Whatman, 1.823.010) in een Costar Sphinx kolom (Corning Incorporated, 8161). Breng de vloeibare deel van het monster op de kolom. Spin voor een min bij 13000 rpm in een 1.5 ml buis. Voeg 0,5 il glycoblue en 40 pi natriumacetaat pH 5,5, en meng het monster. Voeg 1 ml 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. 12. Ligatie van primer aan het 5'-uiteinde van het cDNA Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellets in 8 pi ligatie mix (6,5 ul water; 0,8 pl 10x CircLigase Buffer II; 0,4 ul 50 mM MnCl 2, 0,3 ui, Circligase II [Epicentre]) en incubeer gedurende 1 uur bij 60 ° C. Voeg 30 ul oligo gloeien mix (26 ul water; 3 pl FastDigest Buffer [Fermentas]; 1 pi cut_oligo [10 uM]). Incubeer gedurende 1 min op 95 ° C. Vervolgens de temperatuur te verlagen om de 20 seconden met 1 ° C tot 25 ° C worden bereikt. Voeg 2 pl BamHI (Fast Fermentas) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Voeg 50 ul TE en 0,5 pl glycoblue en meng. Voeg 10 ul natriumacetaat pH 5,5 en mix, voeg 250 ul 100% ethanol. Meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C. 13. PCR-amplificatie Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellet in 19 ul water. Bereid de PCR-mix (19 ul cDNA, 1 ui primer mix P5/P3 Solexa, 10 pM elk; 20 ul Accuprime Supermix een enzym [Invitrogen]). Voer de volgende PCR-programma: 94 ° C gedurende 2 minuten, [94 ° C gedurende 15 sec, 65 ° C gedurende 30 sec, 68 ° C gedurende 30 sec] 25-35 cycli, 68 ° C gedurende 3 min, 4 ° C voor altijd. Mix 8 ul PCR-product met 2 pi van 5x TBE laadbuffer en de belasting op een prefab 6% TBE gel (InvitRogen). Vlekken op de gel met Sybrgreen I (Invitrogen) en te analyseren met een gel imager. De barcode op de Rclip primers laten multiplex verschillende monsters vóór het indienen van voor high throughput sequencing. Submit 15 ul van de bibliotheek voor sequencing en sla de rest. 14. Linker en primer sequenties Pre-adenylated 3 'linker DNA: [We bestellen het DNA-adapter van IDT en vervolgens fracties van 20μM.] 15. Representatieve resultaten: Voorafgaand aan de opeenvolging van de iClip bibliotheek, kan het succes van het experiment te worden gecontroleerd op twee stappen: het autoradiogram van het eiwit-RNA-complex na het membraan transfer (stap 8.5) en de gel imago van de PCR-producten (stap 13.4). In de autoradiogram van de lage-RNase monsters moeten diffuse radioactiviteit te zien boven het molecuulgewicht van het eiwit (figuur 2, monster 4). Voor high-RNase samples, is deze radioactiviteit dichter bij het molecuulgewicht van het eiwit (figuur 2, voorbeeld 3) gericht. Als er geen antilichaam wordt gebruikt in de immunoprecipitatie, zou er geen signaal worden gedetecteerd (Figuur 2, monsters 1 en 2). Andere belangrijke controles voor de specificiteit van de immunoprecipitatie of weglaten UV-straling of gebruik cellen die niet uitdrukken het eiwit van belang 14. De gel beeld van de PCR-producten (stap 13.4) moet tonen een groot bereik dat overeenkomt met het cDNA fractie (hoog, gemiddeld of laag) gezuiverd in stap 11.4 (figuur 4, lanen 4-6). Merk op dat de PCR-primers P3Solexa en P5Solexa een extra 76 nt kennis maken met de grootte van de cDNA. Als er geen antilichaam wordt gebruikt tijdens de immunoprecipitatie, mag geen overeenkomstige PCR-producten worden gedetecteerd (Figuur 4, lanen 1-3). Primer dimeer product kan verschijnen op ongeveer 140 nt. Voor representatieve resultaten van high-throughput sequencing en de daarop volgende bioinformatica analyses zie 14. Figuur 1. Schematische weergave van de iClip protocol. Eiwit-RNA complexen covalent verknoopt in vivo met behulp van UV-bestraling (stap 1). Het eiwit van belang is samen gezuiverd met het gebonden RNA (stappen 2-5). Te zorgen voor sequentie-specifieke priming van de reverse transcriptie, is een RNA-adapter geligeerd aan het 3 'uiteinde van het RNA, terwijl het 5' einde is radioactief gelabeld (stappen 6 en 7). Cross-linked eiwit-RNA-complexen zijn gezuiverd van de gratis RNA met behulp van SDS-PAGE en membraan transfer (stap 8). Het RNA wordt teruggewonnen uit het membraan door het verteren van het eiwit met proteinase K het verlaten van een polypeptide blijven bij de cross-link nucleotide (stap 9). Reverse transcriptie (RT) afgekapt bij de resterende polypeptide en introduceert twee splitsbaar adapter regio's en barcode sequenties (stap 10). Maat selectie verwijdert gratis RT-primer voor circularization. De volgende linearisatie genereert geschikt voor de PCR-amplificatie (stap 11-15). Tot slot, high-throughput sequencing genereert leest waarin de barcode sequenties onmiddellijk gevolgd door de laatste nucleotide van het cDNA (stap 16). Aangezien dit nucleotide lokaliseert een positie stroomopwaarts van de cross-linked nucleotide, kan de bindingsplaats worden afgeleid met een hoge resolutie. Figuur 2. Autoradiogram van cross-linked hnRNP C-RNA complexen met behulp van denaturerende gelelektroforese en membraan overdracht. hnRNP C-RNA complexen werden immuno-gezuiverd van cel extracten met behulp van een antilichaam tegen hnRNP C (α hnRNP C, monsters 3 en 4). RNA werd gedeeltelijk verteerd met behulp van een laag (+) of hoge (+ +) concentratie van RNase. Complexen verschuiving naar boven van de grootte van het eiwit (40 kDa) kan worden waargenomen (voorbeeld 4). De verschuiving is minder uitgesproken bij hoge concentraties van RNase werden gebruikt (voorbeeld 3). Het radioactieve signaal verdwijnt wanneer er geen antilichaam werd gebruikt in de immunoprecipitatie (monsters 1 en 2). Figuur 3. Schematische 6% TBE-ureum gel (Invitrogen) om de excisie van iClip cDNA-producten gids. De gel wordt gerund gedurende 40 minuten op 180 V leidt tot een reproduceerbare migratiepatroon van cDNA's en kleurstoffen (licht en donker blauw) in de gel. Gebruik een scheermesje te snijden (rode lijn) de hoge (H), medium (M) en laag (L) cDNA fracties. Begin met het snijden in het midden van de licht blauwe kleurstof en vlak boven de markering op de plastic gel cassette. Verdeel het medium en de lage fracties en trim de hoge fractie ongeveer 1 cm boven de licht blauwe kleurstof. Gebruik verticaal snijdt laten leiden door de zakken en de kleurstof om de verschillende rijstroken (in dit voorbeeld 1-4) te scheiden. De marker baan (m) kan worden gekleurd en afgebeeld onder controlematen na het snijden. Fragment maten zijn aangegeven op de rechterkant. Figuur 4. Analyse van PCR-geamplificeerd iClip cDNA-bibliotheken met behulp van gelelektroforese. RNA hersteld van het membraan (figuur 1) was omgekeerd getranscribeerd en de grootte-gezuiverd met behulp van denaturerende gelelektroforese (figuur 2). Drie grootte fracties van cDNA (hoge [H]: 120 tot 200 nt, medium [M]: 85 tot 120 nt en lage [L]: 70-85 nt) teruggevonden, circularized, re-gelineariseerde en PCR-geamplificeerd. PCR-producten van verschillende grootte distributie kan worden waargenomen als gevolg van de verschillende maten van de input fracties. Omdat de PCR-primer introduceert 76 nt aan het cDNA, moeten grootte variëren tussen de 196 tot 276 nt voor hoge, 161-196 nt voor middelgrote en 146-161 nt voor de geringe omvang fracties. PCR-producten afwezig zijn wanneer er geen antilichaam werd gebruikt voor de immunoprecipitatie (lanen 1-3).