간단한 기법은 일반적인 세포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.
점점, 패턴의 세포 배양 환경은 세포 특성을 연구하기위한 관련 기술되고 있으며, 많은 연구자들은 더 나은 1-3 생체내 특성의 모방 체외 실험에서 나타내는 3 차원 환경을 필요로 믿습니다. 이러한 암 연구 4, 신경 공학 5, 심장 생리학 6 및 세포 – 매트릭스 7,8 상호 작용과 같은 분야의 연구는 세포의 행동은 전통적인 monolayer 문화 및 3D 구조 사이에 크게 차이가 나타났습니다.
Hydrogels 때문에 그들의 다양한 다재 다능한 및 9-12 작용화 통해 맞게 분자 구성 능력의 3D 환경으로 사용됩니다. 수많은 기법 electrospinning 13 엘라스토머 우표를 포함하여 14 셀 – 지원 매트릭스로 구성 창조를 위해 존재하는, 잉크젯 인쇄 15, 첨가제 photopatterning 16, 정적 photomask 프로젝션 리소그래피 – 17과 동적 마스크 microstereolithography 18. 불행히도, 이러한 방법은 여러 생산 단계 및 / 또는 기존의 세포 및 조직 배양 방법에 쉽게 적응하지 장비를 포함하고 있습니다. 이 프로토콜에 채용된 기술은 UV 시작한 자유 라디칼 중합을 통해 유도된 crosslinking 기하학적으로 구체적인 쓰임새 (에틸렌 글리콜) (PEG) hydrogels에 대한 동적 photomasks을 생성하기 위해 디지털 micromirror 장치 (DMD)를 사용하여, 후자의 두 가지 방법을 적응. 그 결과 "2.5D"구조는 신경 성장을위한 제한된 3D 환경을 제공합니다. 우리는 PEG는 Puramatrix 또는 아가로 오스 중 하나에서 만들어진 달리 못생긴하지만 휴대 허용 자체 조립 젤로 휴대 제한 지역 공급 구조 역할을하는 듀얼 히드로겔 접근 방식을 사용합니다. 이 과정은 기존의 세포 배양 방법 및 기판와 함께 사용하기위한 높은 재현성 쉽게 적응하는 빠르고 간단한 한 단계의 제조이다.
이러한 배아 등의 루트 신경 (DRG)로 전체 조직 explants는, 같은 neurite 가지로 실험 assays를위한 듀얼 히드로겔 구성에 포함될 수 있습니다. 또한, dissociated 세포는 photocrosslinkable 또는 자체 polymerizing 히드로겔에 캡슐이 될 수도 있고, 선택 셀 제한 photopatterning를 사용하여 투과 지원 막을 준수. DMD를 사용하여, 우리는 히드로겔 두께 ~ 1mm까지 구성하지만, 박막은 (<200 μm의) PEG 구조가 자유 라디칼 중합 반응의 산소 담금질에 의해 제한되었다 만들었습니다. 우리는 이후 얇은 PEG 구조 중합을 허용 중합 액체 위에 기름 층을 활용하는 기술을 개발했습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 microfabricated 신경 세포와 조직 문화의 생산을위한 3D 히드로겔 시스템의 급속한 생성을 설명합니다. 시연 듀얼 히드로겔 구조 언급된 세포 생존, 마이 그 레이션 및 / 또는 neurite 성장과지도를 포함한 신경 과학의 연구에 유용 될 수 있습니다 체외 모델에서 다목적 나타냅니다. 또한, 프로토콜 hydrogels 및 세포의 여러 유형에 대해 작업할 수 있듯이, 잠재적인 응용 프로그램은 다양하고 광대한 모두 있습니다.
여기 설명되어있는 방법은 간단하고 재현성 세포 배양 시스템을 추구하는 탐정에 의해 사용될 수 있습니다. 이론적으로 가능한 photopolymerizable hydrogels의 다양한 때문에, 환경은 전체 조직 explants 포함한 모든 세포 유형과 함께 사용할 수 있도록 맞춤 수 있습니다. 또한, 듀얼 히드로겔 시스템은 자신에 비정질 형태를 형성하는 경향이 자기 polymerizing hydrogels의 프레 젠 테이션에 개선 공간적 제어를위한 수 있습니다. 그 결과 "2.5D"micropatterned의 히드로겔 구조 편리 미세한 평가 수있는 2D 구성에서 제시 신경 성장을위한 3D 매트릭스를 제공합니다. 젤이 polymerized하고있는 기판은 또한 실험적인 디자인의 큰 제어를위한 수 있도록 다양한 수 있습니다. 우리의 방법은 우리가 유리 슬라이드 (데이터가 표시되지 않음)에서 중합에 비해 향상된 생존 능력 (그림 4)을 볼 수 있으므로, 세포 배양 투과의 지원과 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 그러나, 다른 중합 표면은 다른 응용 프로그램에 대한 자세한 적용 수 있습니다 유리 제조 예를 들어, microfluidics 실험이나 세포 집계 형성에 사용 슬라이드.
이러한 문화 시스템과 우리의 경험은 어려움의 잠재적인 영역의 식별하게되었다. 첫째,주의 방법은 구성의 불임을 유지하기 위해 필요합니다. DMD 설치의 부피가 큰 특성으로 인해, 그것은 무균 조건 하에서 중합 단계를 작동하기가 어렵습니다. 이 문제를 방지하려면 방법에서 설명한 헹굼 단계에서 도움이되며, 항생제는 모든 미디어에 사용해야합니다. 또한, polymerized 구조의 최종 두께와 모양은 사전 폴리머 혼합물의 유동적인 행동에 크게 의존하고, 초승달 모양의 존재는 (그림 6) 너무 얇은 또는 불완전 polymerized 아르 겔 구성이 발생할 수 있습니다. 두 단계는 세포 배양 삽입 내부 초승달 모양의 형성을 최소화하기 위해 취할 수 있습니다. 두꺼운 hydrogels (> 200 μm의) 삽입의 내부 벽 주위에 비가 X의 단순 코팅 충분하십시오. 그러나, 같이 간단히 얇은 구조 (<200 μm의)을 위해, 위에서 설명한, 기름 층이 모두 초승달 모양을 최소화하고 자유 라디칼 중합의 산소 담금질을 깨뜨릴 필요합니다. 해상도가 점점 두꺼운 젤로 실현 기능의 크기 감소와 함께, 두께에 좌우 되는것 발견되었습니다. 해상도는 또한 기능은 히드로겔에 긍정적이거나 부정적인 구제를 표현 여부에 따라 다양. 그러나, 우리는 광학을 집중로만 현미경 목표를 사용하여 ~ 100 μm의 규모에 대한 최소한의 기능 크기와 구조에 대한 충분한 해상도를 달성했습니다.
우리의 실험은 여기에서 설명한 이중 히드로겔 구조가 neurite 성장과지도의 기본에 – 체외 모델의 형성을위한 훌륭한 기초를 대표하는 것으로 나타났습니다. 고용 micropatterning 기술은 기존의 방법 18,19의 적응이지만, 우리의 세트 업 디자인을 구현하는 간단한을 강조하고 세포 배양 삽입에 듀얼 히드로겔 구성 생산에 최적화된되었다; 세포 배양 삽입뿐만 아니라 세포 생존을 향상 줬어요 이전 자기편 조직 explants 주변 crosslinking로. 표시된 결과의 범위는 우리 연구소의 이익에 의해 제한되지만, 우리는이 책자에서 설명하는 방법 3D 세포 배양의 제조에 대해 상대적으로 싸고, 빠르고 사용하기 쉬운 방법을 찾고 연구에 유용하게 될 것입니다 모델.
The authors have nothing to disclose.
저자는 절개와 문화를 DRG 그들의 전문 지식을 공유하기위한 교수 앤서니 Windebank의 실험실 감사의 마음을뿐만 아니라, DMD 설치에 관한 도움이 토론에 대한 교수 Shaochen 첸 것입니다. 이 연구는 리젠트의 루이지애나위원회 툴란 대학 및 보조금에 의해 일부 자금했다 (LEQSF [2009-10] – RD – A – 18)와 NIH (NS065374).
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Digital Micromirror Device | Texas Instruments | DLPD4X00KIT | ||
Collagen Coated Transwell Permeable Support | Corning | 3491 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Polyester Transwell Permable Support | Corning | 3412 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-036 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-164 | ||
Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | ||
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
DPBS | Invitrogen | 14190-250 | ||
Puramatrix | BD Biosciences | 354250 | ||
PEG 1000 | Polysciences, Inc. | 15178 | ||
Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | 0298913AB | ||
Oil | Have used both canola oil and silicon oil | Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation | ||
OmniCure Series 1000 | Exfo | |||
Rain-X |