L'analisi del trascrittoma di singole cellule

1. Colture Cellulari Il nostro laboratorio utilizza colture primarie di neuroni dell'ippocampo di ratto per gli esperimenti di seguito. Di seguito viene descritto il protocollo banchiere modificato per come queste colture cellulari sono stati creati e mantenuti. 9 Ci sono, naturalmente, un insieme esaustivo di permutazioni di queste tecniche di coltura cellulare e qualsiasi altro metodo stabilito su misura per le esigenze specifiche di un particolare laboratorio che fornisce un fornitura consistente di cellule sane sarebbe un sostituto adatto. Cinque in autoclave, rotondo, 12 coprioggetto mm sono poste in un piatto di 35 mm e rivestiti con 80 mg / ml Poly-D-lisina (MW 70-150,000) in tampone borato O / N, sciacquata con acqua (cultura grado cellulari), poi rivestito con 1 mg / mL Laminina in tampone borato O / N poi nuovamente sciacquati con acqua. NG media (MEM con sali di Earle e GlutaMAX integrato con glucosio (0,6% w / v), la penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mg / ml), siero di cavallo (10% v / v)) è aggiunto e piatti sono memorizzati in un incubatore (5% CO 2 a 37 ° C). Il PDL150/laminin funge da substrato per i neuroni isolati di crescere come un monostrato. I coprioggetti possono essere rivestite fino a due settimane prima della placcatura. Il giorno della placcatura, neuroni primari da embrioni di ratto giorni ippocampo di 18 sono placcati in mezzi NG con l'aggiunta di 1,5 ml di 100.000 cellule / ml di sospensione. Da quattro a sei ore dopo placcatura, ogni piatto 35 mm è trattata con 0,75 l di 5 mM citosina beta-D-arabinofuranoside (ara-C) per prevenire la crescita di eventuali cellule contaminanti gliali. Ventiquattro ore dopo, i media placcatura viene modificato in MEM con sali di Earle e L-glutamina integrato con 0,6% w / v di glucosio, 1 mM sodio piruvato, e B27. Le cellule sono permesso di crescere per almeno due settimane prima di utilizzare in qualsiasi esperimenti per consentire lo sviluppo completo dei processi. 2. Pipette preparazione Nota sulla RNasi: La pelle, la saliva, e persino il respiro sono le principali fonti di RNasi, enzimi che degradano l'RNA. E 'imperativo che RNasi-free tecnica di essere osservata da questo punto in poi nel protocollo in modo che il campione non contaminato con RNasi e successivamente degradare. Questo include indossando sempre i guanti quando si maneggiano i campioni e reagenti, non parlando più di campioni o reagenti, e utilizzando nuove scatole di puntali per pipette sterilizzate e tubi. Spesso, pipette che non sono designati esclusivamente per il lavoro RNA sono decontaminati pulendo delicatamente con una soluzione di trattamento RNasi come RNasi AWAY (Bioproducts Molecolare). Tuttavia, queste soluzioni inibire eventuali reazioni enzimatiche a valle ed è quindi importante anche per prevenire la contaminazione dei campioni con questi trattamenti. Autoclave 1,5 millimetri di diametro esterno (OD) pipette di vetro. Con un estrattore micropipetta, pipette per tirare un diametro appropriato per registrazioni elettrofisiologiche, che possono variare in base alla estrattore, filamento, e pipette. 10 Le dimensioni del foro non è troppo critica in quanto la punta sarà rotto prima della raccolta delle cellule. Conservare con cura le pipette in un ambiente privo di polvere, dove le punte rimarrà intatta (l'ideale sarebbe usare un barattolo micropipetta di stoccaggio). Per rompere la punta in modo controllato, in possesso di un kimwipe teso tra le dita in una mano e molto delicatamente pennello la punta della pipetta attraverso l'1 a 2 volte la carta. L'apertura dovrebbe essere di circa 75-100% della dimensione della cella di destinazione. Regolare questo passo fino ad ottenere il risultato desiderato. 3. Cultura preparazione, Tubi, e microscopio Preparare il numero desiderato di 1,7 ml provette Eppendorf. Aggiungere 2 ml di PBS, buffer primo lido se il materiale deve essere utilizzato per amplificazioni singola cellula, o qualsiasi altra soluzione per lo stoccaggio del materiale raccolto. Per la raccolta, avrete bisogno di un microscopio ottico con un obiettivo 40x dotato di un micromanipolatore. Usare un supporto pipetta con tubi flessibili che si allontana dal supporto. Fissare il tubo di una superficie stabile per impedire movimenti indesiderati della pipetta durante la raccolta. Alla fine del tubo, inserire un ago in modo che una siringa da 1 ml con Luer-Lock connessione può essere collegato e cambiato tra gli utenti. Se si utilizza coprioggetto, lavorare con un coprioggetti alla volta. Se necessario, il trasferimento di un coprioggetto singolo ad un nuovo 35 mm * piatto contenente PBS o supporti di scelta. Più a lungo le cellule sono fuori dell'incubatore, il più malsano che diventerà e tanto più i loro profili di mRNA si discosterà da quella di una cellula sana. E 'fondamentale per preservare la salute delle cellule del coprioggetto altri tenendoli in incubatrice quando non lavora con loro. Lavoro il più rapidamente possibile con le cellule al di fuori del termostato. * Con la nostra impostazione è necessario utilizzare il coperchio di un piatto 35 millimetri in quanto le pareti del piatto reali sono troppo elevati per consentire l'avanzamento corretto del micropipetta verso il coverslip. 4. Cellule raccolta Fissare la micropipetta nel supporto micropipetta. Apporre micropipetta titolare l'inserto sul micromanipolatori. Ha fissato l'obiettivo 40x. Porre la capsula sul palco microscopio e trovare una regione di celle adatte per il raccolto. Nel caso di colture primarie neuronali, la cellula dovrebbe essere relativamente isolato dai suoi vicini per prevenire raccolta delle cellule circostanti e / o processi. La popolazione di trascritti mRNA tra il soma e processi variano, quindi se interessati ad somatiche mRNA solo, occorre prestare attenzione per evitare la contaminazione del soma con i processi. Mettere la cella che si desidera raccogliere al centro del campo visivo. Utilizzare il micromanipolatore per far avanzare la micropipetta verso la soluzione nel piatto nel percorso della luce. Abbassare la punta della pipetta nella soluzione. Applicare una pressione positiva da questo punto in soffiando leggermente attraverso la siringa. Guardare attraverso l'oculare. La pipetta deve apparire come un'ombra nel campo visivo. Ben al di sopra del piano delle celle, regolare la posizione della punta della pipetta fino a quando non è all'interno del campo visivo e mettere a fuoco la punta della pipetta utilizzando le manopole grossolana messa a fuoco. A questo punto, dovrebbe essere valutato se le dimensioni del foro della pipetta è troppo grande o troppo piccolo. Raccolta pratica fornirà la possibilità di determinare se il formato corretto alesaggio è stato raggiunto a questo punto. Ora, far avanzare la pipetta verso il piano delle cellule. E 'importante che la punta non è avanzata troppo in fretta, causando la rottura della regione da cui si desidera raccogliere. Per evitare questo, utilizzare la messa a fuoco grossolana per far avanzare il piano focale prima di avanzare la punta della pipetta verso le cellule usando il micromanipolatori. Quando siete vicini alle cellule, utilizzare la messa a fuoco bene fino a quando entrambe le celle e la punta della pipetta sono a fuoco. Interrompere l'applicazione di pressione positiva prima di raggiungere il piano delle celle per evitare che soffia loro al largo del coprioggetto. Utilizzare il micromanipolatori per posizionare la punta della pipetta in modo che sia toccando la soma delle cellule che si desidera raccogliere. Utilizzando la siringa, applicare l'aspirazione delicata per via orale fino a quando la cellula entra la punta della pipetta. Se la cella non sta entrando la pipetta, spostare delicatamente la punta più vicino alla cella e verso il basso fino a che è dal coprioggetto. 5. Salvataggio della cella Utilizzare il micromanipolatore per spostare immediatamente la pipetta e fuori la soluzione. Rimuovere la pipetta dalla titolare. Tenere il tubo Eppendorf 1,7 ml in una mano e dolcemente rompere la punta della pipetta sul lato del tubo verso il basso. (Obiettivo per il 0,1 mL segno.) Con la punta spezzata centrato all'interno del tubo, inserire un ago inserito in una siringa ml 1-3 nell'apertura superiore della pipetta. Rapidamente spingere il pistone forzando la soluzione nella pipetta di spruzzare fuori nel tubo. La cella deve rimanere nella punta della pipetta e questo dovrebbe essere sufficiente per espellere correttamente la cella. Fare attenzione a non toccare la punta di qualsiasi liquido sui lati del tubo come azione capillare porterà nuovamente il liquido nella pipetta. Rapidamente rallenta il contenuto della provetta con un microcentrifuga desktop e congelare immediatamente (conservare a -80 ° C) o posto in ghiaccio per ulteriori elaborazioni (preferibile). 6. ARNA Amplificazione Round 1 sintesi Primo aspetto cDNA: Crea mRNA / cDNA ibridi. Per ogni 5 microlitri di unico volume la raccolta delle cellule, aggiungere 1x delle seguenti operazioni per il tubo di raccolta (sul ghiaccio). La reazione può essere scalato per grandi volumi di raccolta (2x per 10 microlitri volumi di raccolta, ecc.) Creare un master mix moltiplicando i seguenti reagenti per il numero di provette di raccolta, più 10-20% per tenere conto di pipettaggio errore. Fate questo per ogni successiva reazione nella procedura di amplificazione ARNA. ON ICE 1,2 microlitri dNTP (2,5 mm ciascuno) 2,4 microlitri di buffer 5x prima parte 0,3 microlitri T7-oligo (dT) primer (100 ng / mL) DTT 1,2 microlitri (100 mm) Portare il volume fino al 10,25 microlitri di acqua priva di nucleasi. Mix pipetta e girare brevemente con una microcentrifuga. Incubare per 5 minuti in 70 ° C per denaturare le strutture secondarie dell'mRNA. Immediatamente posto in ghiaccio per almeno 5 minuti. Aggiungere (sempre utilizzando un mix master): RNasin 0,3 microlitri (40 U / mL) 0,45 microlitri Apice III (200 U / mL) 1 ml di acqua priva di nucleasi Pipetta mix e una breve rotazione. Incubare per 1 ora a 42 ° C. Incubare a 70 ° C per 15 minuti per inattivare il Apice. Continuare con il passo successivo. Round 1 sintesi secondo aspetto cDNA Crea primer RNA dalla parte mRNA del mRNA / DNA ibrido per aiutare nella sintesi of doppia elica del DNA. ON ICE Per la reazione di 12 microlitri primo filone, aggiungere: 8 microlitri di acqua priva di nucleasi 7,5 microlitri di buffer 5x secondo aspetto 0,75 microlitri dNTP mix (2,5 mm ciascuno) 0,25 microlitri di DNA ligasi (10 U / mL) 1 microlitri DNA polimerasi I (10 U / mL) 0,25 microlitri RNasi H (2 U / mL) Mescolare accuratamente pipettando e spin brevemente. Incubare per 2 ore a 16 ° C. Aggiungi: 1 microlitri di DNA polimerasi T4 (5 U / mL). Mescolare pipettando e brevemente spin. Incubare 10 minuti a 16 ° C. Pulire la reazione utilizzando il kit Qiagen MinElute secondo le istruzioni del produttore con lievi modifiche: 11 Lavare 2 volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio invece di 1 volta con 750 microlitri. Eluire in acqua priva di nucleasi. Concentrato a 2-4 microlitri utilizzando un Speedvac o per precipitazione dell'etanolo. Per la precipitazione in etanolo, il glicogeno funge da trasportatore di acidi nucleici e viene utilizzato quando precipitare piccole quantità di DNA o RNA. Il sodio da acetato di sodio aiuta a neutralizzare la carica negativa della spina dorsale del DNA, favorendo delle precipitazioni. Non è necessario fare un master mix per precipitazioni di routine. Aggiungere 29 microlitri di acqua DEPC 2 glicogeno microlitri (5mg/ml) 1 / 10 del volume (3 ml) di sodio acetato 3M 2,5 volumi (~ 250 mL) etanolo freddo al 100% Mescolare bene. Precipitato a -80 ° C (30 min. A O / N). Centrifugare per 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 800 microlitri di etanolo al 70%. Assicurarsi di rimuovere completamente il pellet sia pipettando o vortex per favorire l'eliminazione del sale in eccesso. Centrifugare per altri 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e asciugare all'aria per 15-20 minuti. Risospendere in 4 ml di acqua priva di nucleasi. Conservare a -20 o -80 ° C o proseguire per il passo successivo. Nel 1 ° turno di trascrizione in vitro (IVT): Sintetizzare RNA antisenso dal promotore T7 incorporato nel cDNA a doppio filamento. Questa reazione viene eseguita utilizzando il Ambion MEGAscript T7 kit secondo le istruzioni del produttore, tranne in scala per un microlitri 10 invece di una reazione di 20 l 12. E 'imperativo per assemblare questa reazione a temperatura ambiente e di mantenere il tampone a temperatura ambiente durante il montaggio. Il buffer forniti verranno precipitare il DNA, se è freddo ghiaccio. Tenere il NTP e mescolare enzima su ghiaccio quando non in uso. A TEMPERATURA AMBIENTE Trasferire il cDNA a doppio filamento risospeso ad un sottile tubo murato PCR. Aggiungere 4 microlitri NTP mix (18,75 mm ciascuno) Buffer di 1 microlitri di reazione 10x 1 mix microlitri enzima 10x Incubare 14 ore a 37 ° C in un termociclatore (preferibile) o in un incubatore. Questa reazione può essere pulito utilizzando due metodi differenti seguita dalla concentrazione del campione mediante una Speedvac o precipitazione in etanolo. Per la pulizia utilizzando un kit, procedere al Metodo A. Per la pulizia con una estrazione standard di fenolo / cloroformio, procedere con il metodo B. Metodo A: Pulire la reazione utilizzando il kit Megaclear Ambion secondo le istruzioni del produttore con alcune modifiche 13: Lavare 2 volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio invece di 1 volta con 750 microlitri. Per la fase di eluizione, aggiungere 50 ml di acqua priva di nucleasi al centro della colonna, incubare a 70 ° C per 10 minuti. Spin a 10.000 g per 1 min. Ripetere in una nuova provetta. Combinare eluati. Concentrato campione a 2-4 microlitri utilizzando un Speedvac O per precipitazione etanolo. Per precipitazione in etanolo: acetato d'ammonio è usato al posto di acetato di sodio in questo caso perché si è efficiente a prevenire co-precipitazione di nucleotidi liberi con l'acido nucleico. Questo è importante per l'alta concentrazione di NTP è usato nella reazione IVT, in grado di inibire le reazioni a valle. Aggiungere 50 microlitri di acqua DEPC 2 glicogeno microlitri (20 mg / ml) 0,6 volumi (37,2 mL) di ammonio acetato 5M 2,5 volumi (~ 180 mL) etanolo freddo Precipitato a -80 ° C (30 min. A O / N) .* Centrifugare per 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 800 microlitri di etanolo al 70% (in acqua priva di nucleasi). Assicurarsi di rimuovere completamente il pellet per rimuovere tutto il sale in eccesso. Centrifugare per altri 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante minuto secco e l'aria 15-20. Risospendere il pellet in 4 microlitri di acqua priva di nucleasi. Metodo B: In alternativa, il ARNA può essere pulito con una serie di estrazione fenolo / cloroformio. Aggiungere 50 microlitri di acqua DEPC 2 glicogeno microlitri (20 mg / ml) 0,6 volumi (37,2 mL)Ammonio acetato 5M 1 volume (98 mL) fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25:24:1 (equilibrati a pH 7,8-8,0) Vortex per 15 secondi. Centrifugare per 1,5 minuti a metà della velocità massima in microcentrifuga da tavolo. Trasferire lo strato superiore acquoso in una nuova provetta contenente 2,5 volumi (245 mL) di etanolo freddo. Precipitato a -80 ° C (30 min. A O / N). Centrifugare per 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare pellet con 800 microlitri di etanolo al 70% (in acqua priva di nucleasi). Assicurarsi di rimuovere completamente il pellet per rimuovere tutto il sale in eccesso. Centrifugare per altri 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante minuto secco e l'aria 15-20. Risospendere il pellet in 4 microlitri di acqua priva di nucleasi. * Il campione può congelare a questa temperatura durante l'incubazione durante la notte. E 'stato dimostrato che questo può effettivamente aumentare la resa degli acidi nucleici. Round 2 sintesi prima componente cDNA ON ICE Aggiungere 1 primer microlitri casuale (0,05 mg / ml) * Di calore a 70 ° C per 10 minuti. Immediatamente posto in ghiaccio per almeno 5 minuti. Aggiungere 2 microlitri di buffer 5x prima parte 1 DTT microlitri (100 mm) 0,5 microlitri dNTP (2,5 mm ciascuno) RNasin 0,5 microlitri (40 U / mL) 1 ml Apice III (200 U / mL) Mescolare accuratamente pipettando e spin brevemente. Lasciar riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. Questo passaggio è necessario per consentire l'estensione dei primer breve casuale prima della reazione di trascrizione inversa viene eseguita. Incubare per 30 minuti a 42 ° C. Calore 5 minuti a 95 ° C per denaturare l'RNA in DNA / RNA ibridi. Mettere in ghiaccio per almeno 5 minuti. Conservare a -20 ° C o -80 ° C o immediatamente passare alla fase successiva. * La concentrazione di primer casuali è importante. Se la concentrazione è troppo alta, il prodotto sarà più troncato con ogni turno di amplificazione. Round 2 sintesi secondo aspetto cDNA ON ICE Aggiungere 2 microlitri T7-oligo (dT) primer (10 ng / mL) * Calore per 5 minuti a 70 ° C. Immediatamente posto in ghiaccio per almeno 5 minuti. Spin brevemente. Aggiungi 43,5 microlitri nucleasi acqua libera 15 microlitri di buffer 5x secondo aspetto 1,5 microlitri dNTP mix (2,5 mm ciascuno) 2 microlitri DNA polimerasi I (10 U / mL) Mescolare accuratamente pipettando e spin brevemente. Incubare per 2 ore a 16 ° C. Aggiungere 2 microlitri di DNA polimerasi T4 (5 U / mL) Mescolare accuratamente pipettando e spin brevemente. Incubare 10 minuti a 16 ° C. Pulire la reazione utilizzando il kit Qiagen Minelute come nella sezione 6.2.3. Concentrato a 2-4 microlitri con un Speedvac o di precipitazione in etanolo, come nelle sezioni da 6.2.4 a 6.2.8. * Si noti la diversa concentrazione stock di T7-oligo (dT) primer rispetto al primo turno la sintesi del secondo filamento cDNA. Nel round 2 trascrizione in vitro Eseguire come nella sezione 6.3. Ripetere sezioni 6,4-6,6 numero desiderato di volte. Si noti che ogni successiva serie di risultati di amplificazione in più brevi prodotti ARNA. Il numero di giri di amplificazione deve essere limitata per questo motivo. Normalmente, da due a tre turni di amplificazione sono sufficienti per amplificare materiale raccolto da una singola cellula per eseguire analisi di microarray. Nel caso di analisi microarray, il terzo turno IVT reazione viene eseguita utilizzando il Illumina TotalPrep kit di amplificazione RNA secondo le istruzioni del produttore. Questa procedura incorpora biotina marcata con UTP nel ARNA che viene poi utilizzato per la rilevazione su un chip di microarray. Misurare la concentrazione di Arna terzo turno con un NanoDrop o Agilent Bioanalyzer con un RNA Nano kit. 7. Rappresentante Risultati Raccolta di successo di una singola cellula da colture primarie neuronali può essere completato in meno di 2 minuti, a seconda attitudinale (vedi Figura 1). Tuttavia, il tempo per la raccolta varia tra sistemi e intervenendo con manipolazione sperimentale. Sottoponendo la singola cellula alla procedura ARNA (vedi figure 4A e 4B) determini importi microgrammi del totale ARNA amplificato e produce un picco caratteristico ampio se analizzato con un Bioanalyzer (vedi figura 3). Tre turni può essere completato in un minimo di tre giorni, consentendo l'analisi rapida di sola espressione genica su cellule. Figura 1. Mostrato è un esempio di un raccolto di successo di un neurone isolato. Noi SeleCTED una regione relativamente bassa densità (A) e avanzato la punta della pipetta verso la cella desiderata (B). La terza immagine (C) mostra il campo di vista dopo che il cellulare era stato raccolto. Si noti che i processi circostanti rimangono sul vetrino. Figura 2. Mostrati sono due immagini di puntali, che sono una dimensione inadeguato per la raccolta efficace. Questi suggerimenti porterà alla raccolta incompleta (A) e la raccolta di ambiente circostante (B), rispettivamente. Figura 3. Raccolto successivo e l'amplificazione, l'analisi utilizzando un Bioanalyzer si raccomanda di esaminare la distribuzione e la quantità di RNA amplificato. Un amplificazione di successo da materiale singola cellula produrrà importi totali nel microgrammi basso e avrà una distribuzione che è liscia e in largo. Figure 4. Schema del primo turno (A) e il secondo turno (B) della procedura ARNA sono mostrati.