ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

1. תא תרבות המעבדה שלנו משתמשת העיקרי בתרבויות עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס עבור הניסויים בהמשך. להלן תיאור פרוטוקול בנקאי שונה כיצד בתרביות תאים אלה נוצרים ומתוחזק. 9 יש, כמובן, מספר ממצה של פרמוטציות של טכניקות אלה culturing התא כל שיטה הוקם המותאמים לצרכים הספציפיים של מעבדה מסוים המספק אספקת בריא באופן עקבי של התאים תהיה תחליף מתאים. חמש autoclaved, עגולים, 12 מ"מ coverslips ממוקמות בצלחת 35 מ"מ מצופה 80 מיקרוגרם / מ"ל ​​Poly-D-ליזין (MW 70-150,000) ב borate חיץ O / N, שטפה עם מים (תרבות כיתה התא), ואז מצופה מיקרוגרם 1 / Laminin מ"ל borate חיץ O / N אז שטפה שוב עם מים. NG מדיה (ממ עם מלחים של ארל ו GlutaMAX בתוספת גלוקוז (0.6% w / v), פניצילין (100 U / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), סוס בסרום (10% v / v)) הוא הוסיף ומנות נשמרות באינקובטור (5% CO 2 ב 37 ° C). PDL150/laminin משמש מצע של נוירונים בודדים לצמוח כמנהל monolayer. Coverslips יכולים להיות מצופים עד שבועיים לפני ציפוי. ביום ציפוי, הנוירונים העיקריים מן עובריים 18 יום חולדה hippocampi הם מצופה בתקשורת NG ידי הוספת 1.5 מ"ל של 100,000 תאים / מ"ל ​​ההשעיה. ארבע עד שש שעות לאחר ציפוי, כל מנה 35 מ"מ מטופל עם μL 0.75 של 5 מ"מ ציטוסין beta-D-arabinofuranoside (Ara-C) כדי למנוע הצמיחה של כל ותאי גלייה מזהם. עשרים וארבע שעות מאוחר יותר, התקשורת ציפוי משתנה ממ עם מלחים של ארל ו-L-גלוטמין בתוספת 0.6% w / v גלוקוז, נתרן pyruvate 1 מ"מ, ו – B27. תאים מותר לגדול במשך שבועיים לפחות לפני השימוש בניסויים כלשהו כדי לאפשר התפתחות מלאה של התהליכים. 2. הכנת pipettes הערה על RNases: עור, רוק, ואפילו נשימה הם המקורות העיקריים של RNases, אנזימים לבזות RNA. זה הכרחי כי RNase ללא טכניקה לצפות מנקודה זו ואילך בפרוטוקול כך המדגם לא להזדהם עם RNases ובהמשך לבזות. זה כולל תמיד לובשת כפפות בעת הטיפול דגימות ריאגנטים, מעולם לא מדבר על דוגמאות או חומרים כימיים, וכן באמצעות תיבות החדש של טיפים פיפטה וצינורות מעוקרים. לעתים קרובות, טפטפות שאינן מיועדות אך ורק לעבודה RNA הם חיטוי על ידי מנגב אותם עם פתרון טיפול RNase כגון RNase חוץ (Bioproducts מולקולרית). עם זאת, הפתרונות הללו תעכב תגובות אנזימטיות הזרם כל כך חשוב גם על מנת למנוע זיהום של דגימות שלך עם טיפולים אלה. החיטוי 1.5 מ"מ קוטר חיצוני (OD) זכוכית pipettes. בעזרת חולץ micropipette, למשוך pipettes לקוטר המתאים הקלטות אלקטרו, אשר עשוי להשתנות בהתאם חולץ שלך, נימה, ו pipettes. 10 גודל נשא אינו קריטי מדי מאז קצה יישבר קודם אוסף תאים. בזהירות בחנות pipettes בסביבת אבק ללא שבו טיפים יישאר ללא שינוי (רצוי להשתמש קנקן micropipette). כדי לשבור את קצה בצורה מבוקרת, לקיים kimwipe מתוח בין האצבעות ביד אחת בעדינות את קצה המכחול פיפטה על פני 1-2 פעמים הנייר. הפתיחה צריכה להיות כ 75-100% של גודל תא היעד. התאם שלב זה עד לך להשיג את התוצאה הרצויה. 3. הכנת תרבות, צינורות, ו מיקרוסקופ הכן את המספר הרצוי של 1.7 צינורות מ"ל Eppendorf. הוסף 2 μL של חיץ, גדיל PBS הראשון, אם החומר הוא לשמש amplifications תא בודד, או כל פתרון אחר לאחסון החומר נאסף. לקציר, תצטרך מיקרוסקופ אור עם מטרה 40X מצויד micromanipulator. השתמש בעל טפטפת עם צינור גמיש המוביל מן המחזיק. לצרף את צינורות אל משטח יציב כדי למנוע תנועה לא רצויה של פיפטה במהלך איסוף. בסופו של צינורות, הכנס מחט כך מזרק 1 מ"ל עם חיבור Luer-Lock יכול להיות מצורף השתנה בין משתמשים. אם אתה משתמש coverslips, לעבוד עם coverslip אחד בכל פעם. במידת הצורך, להעביר coverslip יחיד צלחת 35 מ"מ * חדש המכיל PBS או התקשורת של בחירה. ככל התאים מתוך האינקובטור, בריא יותר הם יהפכו וככל פרופילים mRNA שלהם יהיה לסטות מזה של תא בריא. זה קריטי לשמירה על בריאותם של התאים על coverslips אחרות על ידי שמירה על אותם בחממה כאשר לא לעבוד איתם. עבודה מהר ככל האפשר עם תאים מחוץ לחממה. * עם ההגדרה שלנו יש צורך להשתמש במכסה של קערת 35 מ"מ מאז קירות צלחת בפועל גבוהות מדי, כדי לאפשר התקדמות נאותה של micropipette לכיוון coversliעמ ' 4. קצירת התאים אבטח את micropipette ב בעל micropipette. להטביע micropipette בעל להכניס את על micromanipulators. הגדר את מטרת 40X. מניחים את המנה על הבמה מיקרוסקופ למצוא באזור של תאים מתאים הקציר. במקרה של תרבויות העצבית העיקרי, התא צריך להיות מבודד יחסית לשכנותיה כדי למנוע יבול של התאים הסמוכים ו / או תהליכים. אוכלוסיית תעתיקי mRNA בין סומה תהליכי להשתנות, ולכן אם מעוניין סומטיים mRNAs בלבד, יש להקפיד על מנת למנוע זיהום של סומה עם תהליכים. הנח את תא אתה רוצה לקצור במרכז שדה הראייה. השתמש micromanipulator לקדם את micropipette לקראת פתרון של התבשיל לתוך נתיב האור. מנמיכים את קצה פיפטה לתוך התמיסה. החל לחץ חיובי מנקודה זו על ידי נושבת בקלילות דרך המזרק. תסתכל דרך העינית. פיפטה אמור להופיע כצל בתחום התצוגה. ובכן מעל למישור של התאים, להתאים את המיקום של קצה פיפטה עד שהוא בתוך שדה הראייה ולהתמקד קצה פיפטה באמצעות ידיות התמקדות גס. בשלב זה, יש לבחון אם גודל נשא של פיפטה גדולה מדי או קטנה מדי. קצירת עיסוק תספק את היכולת לקבוע אם גודל נשא לתקן הושגה בשלב זה. עכשיו, לקדם את פיפטה לעבר המטוס של התאים. חשוב קצה אינה מתקדמת במהירות מדי, גורם לו לשבור באזור שממנו אתם רוצים לגבות. כדי למנוע זאת, השתמש להתמקד גס על מנת לקדם את מישור המוקד לפני לקידום קצה פיפטה אל התאים באמצעות micromanipulators. כאשר אתה קרוב תאים, השתמש להתמקד בסדר עד שני התאים את קצה פיפטה נמצאים בפוקוס. עצור הפעלת לחץ חיובי לפני שתגיע מטוס של תאים כדי למנוע פיצוץ של אותם coverslip. השתמש micromanipulators עמדת קצה פיפטה כך נוגע סומה תא ברצונך הקציר. שימוש במזרק, להחיל שאיבה עדינה דרך הפה עד התא נכנס קצה פיפטה. אם התא לא נכנסת פיפטה, להזיז בעדינות את קצה קרוב התא כלפי מטה עד שהוא מרים מן coverslip. 5. שמירת Cell השתמש micromanipulator מיד להעביר את פיפטה מעלה את הפתרון. הסר את פיפטה מבעל. החזק את 1.7 מ"ל Eppendorf צינור ביד אחת בעדינות לשבור את קצה פיפטה בצד של הצינור כלפי מטה. (AIM עבור 0.1 מ"ל סימן.) עם קצה שבור מרוכז בתוך הצינור, להכניס מחט מחוברת למזרק 1-3 מ"ל לתוך הפתח העליון של פיפטה. במהירות לוחץ על המתג לכפות פתרון פיפטה לרסס לתוך הצינור. התא צריך להישאר טיפ מאוד של פיפטה וזה צריך להיות מספיק שצריך לגרש את התא. היזהר שלא לגעת בקצה לנוזל כלשהו על הצדדים של הצינור כפעולה נימי יהיה להחזיר את הנוזל לתוך פיפטה. ספין למטה במהירות את התוכן של הצינור באמצעות microfuge שולחניים להקפיא מיד (החנות ב -80 ° C) או על קרח מקום לעיבוד נוסף (עדיף). 6. ארנה הגברה סיבוב 1 סינתזת גדיל ראשון cDNA: יצירת mRNA / כלאיים cDNA. במשך כל μL 5 נפח תא בודד אוסף, להוסיף 1x מהפעולות הבאות כדי צינור האיסוף (על הקרח). התגובה יכולה להיות scaled עד כרכים עבור אוסף גדול (10 כרכים 2x עבור אוסף μL וכו '). יצירת תערובת אמן על ידי הכפלת ריאגנטים הבאה במספר צינורות אוסף פלוס 10-20% כדי להסביר pipetting שגיאה. האם זה מאוחר מדי עבור תגובה בהליך ampification ארנה. ON ICE 1.2 μL dNTP של (2.5 מ"מ כל אחד) 2.4 גדיל μL 5x ראשון חיץ 0.3 μL T7-אוליגו (DT) פריימר (100 ng / μL) 1.2 DTT μL (100 מ"מ) תביאו את נפח עד μL 10.25 עם מים חינם nuclease. לערבב פיפטה ספין בקצרה באמצעות microfuge. דגירה למשך 5 דקות בשעה 70 ° C עד לפגל כל מבנה המשני של ה-mRNA. מיד מקום על הקרח לפחות 5 דקות. הוסף (שוב באמצעות שילוב אב): 0.3 RNasin μL (40 U / μL) 0.45 μL כתב עילי III (200 U / μL) 1 מים μL nuclease חינם פיפטה לערבב בקצרה ספין. דגירה במשך שעה 1 ב 42 ° C. לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית כתב עילי. המשיכו לשלב הבא. סיבוב 1 סינתזת הגדיל השני cDNA צור primers RNA מן החלק של ה-mRNA mRNA היברידי / DNA כדי לסייע סינתזה of גדילי כפול cDNA. ON ICE כדי התגובה גדיל μL 12 הראשונים, להוסיף: 8 מים μL nuclease חינם 7.5 גדיל μL 5x השנייה חיץ 0.75 תערובת μL dNTP (2.5 מ"מ כל אחד) 0.25-DNA האנזים μL (10 U / μL) 1 דנ"א פולימראז μL אני (10 U / μL) 0.25 μL Rnase H (2 U / μL) מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. דגירה עבור 2 שעות 16 ° C. הוסף: 1-DNA פולימראז μL T4 (5 U / μL). מערבבים על ידי pipetting ובקצרה ספין. דגירה 10 דקות נוספות ב 16 ° C. לנקות את התגובה באמצעות MinElute Qiagen הערכה לפי הוראות היצרן עם שינויים קלים: 11 Wash 2 פעמים עם חיץ 500 לשטוף μL במקום פעם 1 עם μL 750. Elute במים nuclease חינם. להתרכז כדי μL 2-4 באמצעות Speedvac או על ידי משקעים אתנול. עבור המשקעים אתנול, גליקוגן המעשים כנשא חומצות גרעין מזרז משמש כאשר כמויות קטנות של דנ"א או רנ"א. נתרן אצטט מתוך נתרן עוזר לנטרל את מטען שלילי של עמוד השדרה DNA, בסיוע בכמות המשקעים. אין צורך להכין תערובת אב precipitations שגרתית. מוסיפים מים 29 DEPC μL 2 הגליקוגן μL (5mg/mL) 1 / 10 נפח (3 μL) נתרן אצטט 3M 2.5 כרכים (~ 250 μL) 100% אתנול קר מערבבים היטב. להאיץ ב -80 ° C (30 min. ל O / N). צנטריפוגה במשך 20 דקות 4 ° C. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 70% אתנול 800 μL. הקפד מלא לעקור את גלולה או על ידי pipetting או vortexing לסייע בסילוק עודפי מלח. צנטריפוגה לעוד 20 דקות 4 ° C. הסר את supernatant ואוויר יבש במשך 15-20 דקות. Resuspend ב μL 4 מים חינם nuclease. חנות ב -20 או -80 ° C או להמשיך לשלב הבא. סיבוב 1 ב שעתוק במבחנה (IVT): Antisense לסנתז RNA מן האמרגן T7 שולבו cDNA גדילי כפול. תגובה זו מתבצעת באמצעות MEGAscript Ambion T7 הערכה לפי הוראות היצרן, למעט מדורגים עבור μL 10 במקום תגובה 20 μL. 12 זה הכרחי כדי להרכיב את התגובה בטמפרטורת החדר כדי לשמור על חיץ בטמפרטורת החדר במהלך העצרת. המאגר יהיה סיפק להאיץ את ה-DNA אם הוא קר כקרח. שמור את NTPs ומערבבים האנזים על הקרח כאשר אינו בשימוש. בטמפרטורת החדר מעבירים את cDNA גדילי כפול resuspended אל צינור דק PCR חומה. הוסף 4 μL NTP לערבב (18.75 mM כל אחת) 1 μL התגובה 10x חיץ 1 μL אנזים 10x לערבב דגירה 14 שעות ב 37 מעלות צלזיוס thermocycler (עדיף) או בחממה. תגובה זו ניתן לנקות באמצעות שתי שיטות שונות ואחריו ריכוז של המדגם באמצעות Speedvac משקעים או אתנול. עבור ניקוי בעזרת ערכת, המשך א שיטה לנקות עם החילוץ פנול / כלורופורם סטנדרטי, המשך שיטת B. שיטה א: לנקות את התגובה באמצעות ערכת AMBION Megaclear לפי הוראות היצרן עם כמה שינויים 13: לשטוף 2 פעמים עם חיץ 500 לשטוף μL במקום פעם 1 עם μL 750. עבור השלב elution, להוסיף 50 μL מים nuclease חופשית אל מרכז הטור, דגירה על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ספין על g 10,000 דקות 1. חזור בצינור טריים. שלב eluates. תתרכז מדגם μL 2-4 באמצעות Speedvac או על ידי משקעים אתנול. עבור משקעים אתנול: אמוניום אצטט משמש במקום נתרן אצטט במקרה זה כי היא יעילה במניעת שיתוף משקעים של נוקלאוטידים חינם עם חומצת גרעין. זה חשוב כי ריכוז גבוה של NTP משמש בתגובה IVT, אשר יכול לעכב תגובות במורד הזרם. מוסיפים מים 50 DEPC μL 2 הגליקוגן μL (20 מ"ג / מ"ל) 0.6 כרכים (37.2 μL) אמוניום אצטט 5M 2.5 כרכים (~ 180 μL) קר אתנול להאיץ ב -80 ° C (30 min. ל O / N) .* צנטריפוגה במשך 20 דקות 4 ° C. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 70% אתנול 800 μL (מים חופשי nuclease). הקפד מלא לעקור את גלולה להסיר את כל עודפי המלח. צנטריפוגה לעוד 20 דקות 4 ° C. הסר supernatant ואוויר יבש 15-20 דקות. Resuspend גלולה במים 4 nuclease μL חינם. שיטה ב: לחלופין, ארנה ניתן לנקות עם החילוץ פנול / כלורופורם סטנדרטי. מוסיפים מים 50 DEPC μL 2 הגליקוגן μL (20 מ"ג / מ"ל) 0.6 כרכים (37.2 μL)אמוניום אצטט 5M 1 נפח (98 μL) פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול 25:24:1 (equilibrated עד pH 7.8-8.0) וורטקס למשך 15 שניות. צנטריפוגה עבור 1.5 דקות בחצי המהירות המקסימלית ב microcentrifuge העליון בטבלה. מעבירים את השכבה המימית מלמעלה צינור חדש המכיל 2.5 כרכים (245 μL) של אתנול קר. להאיץ ב -80 ° C (30 min. ל O / N). צנטריפוגה במשך 20 דקות 4 ° C. הסר supernatant ולשטוף גלולה עם 70% אתנול 800 μL (מים חופשי nuclease). הקפד מלא לעקור את גלולה להסיר את כל עודפי המלח. צנטריפוגה לעוד 20 דקות 4 ° C. הסר supernatant ואוויר יבש 15-20 דקות. Resuspend גלולה במים 4 nuclease μL חינם. * מדגם עשוי להקפיא בטמפרטורה זו במהלך incubations לילה. הוכח כי זה ממש יכול להגדיל תשואה של חומצות גרעין. סיבוב 2 גדיל סינתזה ראשון cDNA ON ICE הוסף 1 primers אקראיים μL (0.05 מ"ג / מ"ל) * מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מיד מקום על הקרח לפחות 5 דקות. הוסף חוצץ 2 μL 5x גדיל ראשון 1 DTT μL (100 מ"מ) 0.5 μL dNTP של (2.5 מ"מ כל אחד) 0.5 RNasin μL (40 U / μL) 1 μL כתב עילי III (200 U / μL) מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. אפשר לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צעד זה נדרש כדי לאפשר הרחבה של primers אקראי קצר לפני התגובה שעתוק לאחור מתבצע. דגירה במשך 30 דקות על 42 ° C. מחממים 5 דקות 95 ° C עד לפגל את הרנ"א ב-DNA / RNA כלאיים. מניחים על קרח במשך לפחות 5 דקות. חנות ב -20 ° C או -80 ° C או מיד להמשיך לשלב הבא. * ריכוז primers אקראי חשוב. אם ריכוז גבוה מדי, המוצר יקוצצו יותר עם כל סיבוב של הגברה. סיבוב 2 גדיל סינתזה השנייה cDNA ON ICE הוסף 2 μL T7-אוליגו (DT) פריימר (10 ng / μL) * חום במשך 5 דקות ב 70 ° C. מיד מקום על הקרח לפחות 5 דקות. ספין בקצרה. הוסף 43.5 μL מים nuclease חינם 15 גדיל μL 5x השנייה חיץ 1.5 תערובת μL dNTP (2.5 מ"מ כל אחד) 2 DNA פולימראז μL אני (10 U / μL) מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. דגירה עבור 2 שעות 16 ° C. הוסף 2 μL DNA פולימראז T4 (5 U / μL) מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. דגירה 10 דקות נוספות ב 16 ° C. לנקות את התגובה באמצעות Minelute Qiagen ערכת בסעיף 6.2.3. להתרכז כדי μL 2-4 עם Speedvac או משקעים אתנול כמו בסעיפים 6.2.4 עד 6.2.8. * הערה ריכוז מניות שונים של T7-אוליגו (DT) תחל בהשוואה לסינתזה גדיל סיבוב בשניה הראשונה cDNA. סיבוב 2 ב שעתוק במבחנה ביצוע כאמור בסעיף 6.3. חזור על סעיפים 6.4-6.6 המספר הרצוי של פעמים. שים לב שכל הסיבוב הבא של תוצאות הגברה ב קצר מוצרי ארנה. מספר סיבובים של הגברה צריך להיות מוגבל מסיבה זו. בדרך כלל, 2-3 סיבובים של הגברה מספיקים כדי להגביר חומר שנקטפו מתא בודד לבצע ניתוח microarray. במקרה של ניתוח microarray, התגובה השלישית בסיבוב IVT מבוצעת באמצעות TotalPrep Illumina קיט הגברה RNA לפי הוראות היצרן. הליך זה כולל ביוטין, שכותרתו UTP לתוך ארנה המשמש לגילוי אז על שבב microarray. למדוד את הריכוז של ארנה בסיבוב השלישי באמצעות Nanodrop או Agilent Bioanalyzer עם RNA ננו ערכת. 7. נציג תוצאות יבול מוצלח של תא בודד מתרבויות עצבי ראשוני יכול להסתיים תוך פחות מ 2 דקות, תלוי כישרון (ראה איור 1). עם זאת, זמן הקציר ינועו בין מערכות עם התערבות מניפולציה ניסויית. חשיפת תא בודד הנוהל ארנה (ראה איורים 4 א ו – 4B) תוצאות בכמויות מיקרוגרם של ארנה מוגבר הכולל מייצר שיא רחב אופייני כאשר ניתח עם bioanalyzer (ראה איור 3). שלושה סיבובים ניתן להשלים מינימום של שלושה ימים, המאפשר ניתוח מהיר של ביטוי גנים תא בודד. באיור 1. מוצג דוגמה יבול מוצלח של נוירון בודד. אנו Selected אזור יחסית בצפיפות נמוכה (A) ומתקדם קצה פיפטה לעבר התא הרצוי (B). התמונה השלישית (ג) מציג את שדה הראיה לאחר התא נקצר. ראוי לציין, כי התהליכים סביב להישאר coverslip. איור 2. מוצג שתי תמונות של טיפים פיפטה, אשר גודל מתאים קצירת יעיל. טיפים אלו יוביל קציר שלם (א) ו קציר סביב המילייה (ב) בהתאמה. איור 3. הקציר הבאים, ניתוח הגברה באמצעות bioanalyzer מומלץ לבחון את התפלגות וכמות של רנ"א מוגבר. הגברה מוצלח מחומר תא בודד תניב סך של מיקרוגרם נמוך תהיה חלוקה זה חלק רחב. איורים 4. שרטוטים של הסיבוב הראשון (A) בסיבוב השני (B) של ההליך ארנה מוצגים.