L'analyse du transcriptome des cellules isolées
Summary
Dans cet article, nous décrivons une méthode simple pour la récolte des cellules isolées de rat cultures primaires de neurones et l'analyse du transcriptome en utilisant une amplification ultérieure ARNa. Cette approche est généralisable à tout type de cellule.
Abstract
Beaucoup de techniques d'analyse d'expression génique fonder sur des documents isolés de populations hétérogènes de cellules à partir d'homogénats de tissus ou cellules en culture. 1,2,3 Dans le cas du cerveau, des régions telles que l'hippocampe contient un agencement complexe de différents types de cellules, chacune avec profils ARNm distincts. La capacité à récolter des cellules individuelles permet une enquête plus approfondie sur les différences moléculaires entre et au sein des populations de cellules. Nous décrivons une méthode simple et rapide pour la récolte de cellules pour un traitement ultérieur. Pipettes souvent utilisé en électrophysiologie sont utilisées pour isoler (par aspiration) une cellule d'intérêt et idéalement de le déposer dans un tube Eppendorf pour un traitement ultérieur avec un certain nombre de techniques de biologie moléculaire. Notre protocole peut être modifié pour la récolte des dendrites partir de culture cellulaire ou même des cellules individuelles à partir de tranches aiguës.
Nous décrivons également la méthode d'amplification ARNa comme une application majeure aval des isolements seule cellule. Cette méthode a été développée précédemment par notre laboratoire comme une alternative aux autres techniques d'analyse d'expression génique tels que transcription inverse ou en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR). 4,5,6,7,8 Cette technique permet l'amplification linéaire de la ARN polyadénylé en commençant par femtogrammes seulement du matériel et résultant en des quantités microgramme d'ARN antisens. Le matériel amplifié linéairement fournit une estimation plus précise que la PCR d'amplification exponentielle de l'abondance relative des composantes du transcriptome de la cellule isolée. La procédure de base se compose de deux cycles d'amplification. En bref, un site T7 RNA polymérase promoteur est incorporé dans ADNc double brin créé à partir des transcrits d'ARNm. Une nuit dans la transcription in vitro (IVT) de réaction est ensuite effectué dans laquelle T7 RNA polymérase produit de nombreux transcrits antisens de l'ADNc double brin. Le second tour répète ce processus, mais avec quelques différences techniques puisque le matériau de départ est un ARN antisens. Il est standard de répéter le second tour, résultant en trois cycles d'amplification. Souvent, la troisième ronde, en réaction de transcription in vitro est réalisée en utilisant nucléosidetriphosphates biotinylé de telle sorte que l'ARN antisens produit peut être hybridée et détectée sur une puce à 7,8.
Protocol
Discussion
Notes et Dépannage
- Vous voudrez peut-être à prendre avant et après des images montrant que la cellule cible a été isolé et que la pénombre reste a été laissé intact.
- Si trop de solution est d'entrer la pipette que vous récoltez, vous pouvez utiliser 3 voies Luer-Lock et le piston de la seringue pour tenir la pression positive dans le tube. Le volume désiré varie avec le type de traitement, mais jusqu'à 5 ul devrait être bon pour la plupart des applications.
Conseils généraux sur les techniques de biologie moléculaire
- Vortex tous les tubes des stocks et les spin-down avant d'ajouter à une réaction. JAMAIS enzymes vortex.
- Bien mélanger avant d'ajouter les réactions de l'enzyme de s'assurer que le tampon est à la concentration appropriée.
- Maintenir les stocks d'enzymes à -20 ° C, si possible en utilisant un stratacooler. Sinon, retirez juste avant utilisation, garder sur la glace, et revenir immédiatement à -20 ° C.
- Toujours faire master mix lors de la préparation plus d'une réaction de réduire les erreurs de pipetage. Calculer le volume nécessaire en fonction du nombre d'échantillons et d'ajouter 10-20%.
- Magasin de l'ARN à -80 ° C à retarder la dégradation. L'ARN est plus stable stocké dans le tampon d'apurination retardent d'ARN qui se produit dans des conditions acides.
Aperçu général de la procédure ARNa
Figure 4A illustre le premier tour de la procédure ARNa. Dans la réaction du premier brin, la portion de poly-T de la T7-oligo (dT) primer sélectionne des espèces d'ARNm (long rectangle blanc) en se liant à la queue polyA. Certains microARN sont également polyadénylé et sera capturé par cette procédure. Plus important, cependant, les ARN les plus abondants dans la cellule, les ARN ribosomal, ne sera pas. Cet oligo agit comme une amorce pour la transcriptase inverse pour synthétiser un brin complémentaire de l'ADNc (rectangle gris de long) en utilisant l'ARNm comme un modèle. La portion de la T7 T7-oligo (dT) primer intègre le promoteur T7 RNA polymérase en phase avec la séquence antisens de l'ARNm de départ. Ceci est utilisé plus tard dans la réaction de transcription in vitro.
Ensuite, l'ARNm dans les hybrides ARNm / ADN créée à l'étape précédente est partiellement hydrolysé par la RNAse H créant ARN "amorces" (petits rectangles blancs) semblables à des fragments d'Okazaki créé dans la synthèse des brins d'ADN à la traîne. ADN polymérase I utilise des fragments d'ARN pour la synthèse d'ADN premiers en utilisant l'ADN complémentaire de l'ARNm comme un modèle. Quand il atteint le fragment suivant l'ARN, son extrémité 5 'à 3' activité nucléase supprime les ribonucléotides et les remplace par des désoxyribonucléotides. L'ADN ligase est ajoutée à ligaturer les brins où le remplacement du brin leader n'est pas complète. ADN polymérase T4 est ajouté pour combler dans les zones où des fragments d'ARN servi comme amorces initiales pour l'ADN polymérase I de créer une extrémité franche ADNc double brin qui est ensuite purifié avant d'effectuer la réaction d'IVT.
Dans la réaction d'IVT, T7 RNA polymérase se lie au promoteur T7 incorporée dans les molécules d'ADNc double brin et synthétise l'ARN antisens (longs rectangles noirs) en utilisant le brin sens comme un modèle. Cela sert l'étape d'amplification dans lequel des milliers de molécules d'ARN antisens sont produites à partir de chaque molécule ADNc double brin (figure 4A).
Le second tour, comme le montre la figure 4B, commence par une réaction de transcription inverse qui est légèrement différent de celui de la première ronde depuis les ARN antisens de départ est (solide rectangle noir) et n'a pas la queue polyadénylée qui était ciblé par la T7-oligo (dT) amorce dans le premier tour. Par conséquent, cette réaction est amorcée avec des amorces aléatoires (petits rectangles gris) et la suite dénaturé ARN. La réaction du deuxième brin est alors amorcée par la T7-oligo (dT) primer, qui se lie à la séquence poly-A à l'extrémité 3 'de l'ARN sens créé dans la réaction de transcription inverse précédent. Une autre réaction d'IVT est effectuée de la même manière que dans le premier tour. Ce second tour est habituellement répétée au moins une fois à atteindre trois cycles d'amplification d'une seule cellule.
Applications
Les techniques que nous avons présenté dans cet article peuvent être traduits dans un grand nombre d'applications. Le protocole seule cellule d'isolement peut être modifié pour une utilisation dans des tranches aiguës. 14 Bien que techniquement plus difficile, les mêmes principes s'appliquent dans cette préparation suppléant. De plus, si la taille de la pipette est légèrement ajustée, les enregistrements de la physiologie des cellules peut être faite avant la récolte permettant de mener une enquête bien contrôlée des mécanismes moléculaires à l'origine des sorties physiologiques. Une autre légère modification est d'isoler les processus du soma cellulaire. 15 Pour cette application, de recueillir les corps cellulaires avec une pipette et ensuite revenir avec une nouvelle pipette et recueillir 100-300 dendrit identifiées ou des axones par tube de collecte 16.
Une fois que les cellules ont été récoltées, les comparaisons des abondances ARNm et compositions peuvent être faites entre différents et même au sein des populations même cellule. Incorporer biotinylé-UTP dans le ARNa troisième tour permet l'analyse des microréseaux afin de déterminer ces abondances relatives d'ARNm. La composition de la population d'ARNm d'origine peut aussi être déterminé après la procédure ARNa utilisant le séquençage de nouvelle génération. Le ARNa amplifié peut également être utilisée pour confirmer les études cellulaires phénotype de conversion dans laquelle un ensemble complet d'ARNm d'un type de cellules sont transfectées dans un type cellulaire différent afin d'induire la transition du phénotype de type cellule dernier dans celui de l'ancien, une procédure développée par le laboratoire et connu sous le nom TIPER. 17 Ces études sont particulièrement utiles pour étudier les états pathologiques et les phénotypes cellulaires et des études sont actuellement en cours dans le laboratoire. RT-PCR ou PCR quantitative peut être effectuée sur le matériel amplifié pour confirmer l'expression de gènes spécifiques de la cellule. En outre, les évaluations de l'efficacité de la transfection ou la transduction peut être faite au niveau de la cellule unique.
Avantages et limites
Comme indiqué dans l'abstrait, l'isolement de cellules uniques pour l'analyse élimine les effets de la moyenne observée avec l'analyse de populations cellulaires hétérogènes. Ces effets moyenne dénaturer l'abondance d'ARNm dans une cellule unique par une sur-représentation des transcriptions abondante et une moyenne de sortir et éviter la détection de nombreux pays à faible abondance de transcriptions. La cytométrie en flux peut être utilisé pour trier des cellules individuelles, mais cette méthode nécessite la connaissance de la cellule des marqueurs spécifiques et des équipements coûteux. 18 microdissection laser, soit avec des systèmes laser UV ou IR microdissection permettent de cellule unique et même capturer subcellulaire, mais nécessite des cellules d'intérêt pour être situés à la surface des sections très minces. 19 Similaire à la cytométrie en flux, microdissection laser nécessite également un équipement coûteux.
Un des principaux avantages de la technique de collecte électrode à base décrit ci-dessus est que de précieuses données électrophysiologiques peuvent être obtenus auprès de la cellule d'intérêt avant la récolte, permettant une analyse fonctionnelle et du transcriptome à effectuer sur la même cellule. 20 Un inconvénient de notre technique est qu'elle exige une expérience en utilisant micromanipulateurs. Les enquêteurs familiers avec micromanipulateurs trouverez cette technique très intuitive, cependant, les individus qui n'ont aucune expérience de ce type devra se familiariser avec les mouvements fins requises.
Inhérentes à toute technique d'amplification est l'amplification préférentielle de certaines transcriptions basée sur la taille et la composition des nucléotides. 4,6,7 réaction en chaîne par polymérase (PCR) des techniques basées telles que transcription inverse réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR) et amplification rapide de l'ADNc extrémités (RACE) résulte de l'amplification exponentielle de transcriptions, tandis que les résultats ARNa procédure d'amplification de l'amplification linéaire. Ainsi, l'un des principaux avantages de la procédure ARNa réside dans sa capacité à mieux préserver l'abondance relative des transcrits d'ARNm par seulement linéairement amplifiant les erreurs ou les préjugés qui se produisent dans le processus d'amplification exponentielle par rapport à l'amplification dudit erreurs et de préjugés.
La procédure ARNa couplée à l'analyse des microréseaux permet la comparaison des abondances d'ARNm entre les cellules simples de morphologie similaire ou différente, traitée ou non traitée. En outre, les produits d'amplification peuvent être soumises pour le séquençage de nouvelle génération. 5,8 Cependant, des précautions doivent être prises dans de telles analyses, car, contrairement à l'utilisation d'amorces aléatoires pour la procédure, la procédure d'oligo-dT amorcée décrit ci-dessus l'amplification des préjugés de l' extrémités 3 'des ARNm et aboutit généralement à léger raccourcissement du matériel amplifié suite à chaque tour. Des précautions doivent être prises dans l'analyse des résultats puce à ADN avec des méthodes standard comme certains faux appels absents peuvent découler de matériel amplifié légèrement raccourcie. En outre, les résultats tout en séquençage sera en effet fournir la pleine 5 'la séquence de la plupart des ARNm d'origine, les séquences 5' de certains ARNm pourrait être manquée. Pour ces raisons, le nombre de tours d'amplifications devrait être limité.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Kevin Miyashiro pour le placage et le maintien des cultures de cellules, le Dr Terri Schochet pour fournir des cultures de cellules pour les photos incluses dans ce document. En outre, merci à Kevin Miyashiro, le Dr Peter Buckley, et Tiina Pertiz pour l'entrée sur la procédure ARNa. Le financement de ce travail a été de l'Institut national sur le vieillissement, l'Institut national sur la santé mentale et les fonds des ressources humaines enquêteur du Commonwealth de Pennsylvanie.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
| Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
| Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
| Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
| Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
| Boric acid | Sigma | B0252 | ||
| MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
| D-glucose | Sigma | G8769 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
| 1ml syringe | BD | 309628 | ||
| Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
| dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
| dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
| Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
| DTT | Supplied with second strand buffer | |||
| E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
| DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
| Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
| Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
| Random primers | BMB | 11034731001 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
| MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
| T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
| Rnasin | Promega | N251B | ||
| Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
| Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
| Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |
Referenzen
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