Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

1. Cel Cultuur Ons laboratorium maakt gebruik van primaire neuronale rat hippocampus culturen voor de experimenten hieronder. Het volgende beschrijft de gewijzigde Banker protocol voor hoe deze celculturen worden gemaakt en onderhouden. 9 Er zijn, uiteraard, een volledig aantal permutaties van deze celcultuur technieken en alle beproefde methode toegesneden op de specifieke behoeften van een bepaalde laboratorium die zorgt voor een consequent gezonde voeding van de cellen zou een geschikte vervanger te zijn. Vijf autoclaaf, rond, 12 mm dekglaasjes worden geplaatst in een 35 mm schotel en bedekt met 80 ng / ml Poly-D-Lysine (MW 70-150,000) in boraatbuffer O / N, gespoeld met water (celkweek graad), dan gecoat met 1 ug / ml Laminine in boraatbuffer O / N vervolgens opnieuw worden gespoeld met water. NG media (MEM met Earle's zouten en Glutamax aangevuld met glucose (0,6% w / v), penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), paarden serum (10% v / v)) wordt toegevoegd en gerechten worden opgeslagen in een incubator (5% CO 2 bij 37 ° C). De PDL150/laminin dient als een substraat voor de geïsoleerde neuronen om op te groeien als een monolaag. De dekglaasjes kan gecoat worden tot twee weken voor de beplating. Op de dag van plating, zijn de primaire neuronen uit embryonale dag 18 rat hippocampus uitgeplaat in NG media door het toevoegen van 1,5 ml van een 100.000 cellen / ml suspensie. Vier tot zes uur na de scheepshuid, elk 35 mm gerecht behandeld met 0,75 pi van 5 mM cytosine beta-D-arabinofuranoside (ara-C) om de groei van een vervuilende gliacellen te voorkomen. Vierentwintig uur later, is de scheepshuid media veranderd in MEM met Earle's zouten en L-glutamine aangevuld met 0,6% w / v glucose, 1 mM natrium pyruvaat, en B27. Cellen worden toegestaan ​​om voor ten minste twee weken groeien voor gebruik in alle experimenten tot volledige ontwikkeling van processen mogelijk te maken. 2. Voorbereiden Pipetten Opmerking over RNases: De huid, speeksel, en zelfs de adem zijn belangrijke bronnen van RNases, enzymen die RNA af te breken. Het is noodzakelijk dat RNase-vrije techniek worden waargenomen vanaf dit punt in het protocol, zodat het monster niet besmet raken met RNases en vervolgens af te breken. Dit omvat altijd het dragen van handschoenen bij het hanteren van de monsters en reagentia, nooit praten over monsters of reagentia, en het gebruik van nieuwe dozen van gesteriliseerde pipet tips en buizen. Vaak zijn pipetten die niet uitsluitend bestemd zijn voor RNA werk ontsmet door af te vegen ze neer met een RNase behandeling oplossing, zoals RNase AWAY (Molecular Bioproducts). Echter, zullen deze oplossingen hinderen van stroomafwaarts enzymatische reacties dus het is ook belangrijk om besmetting van uw monsters te voorkomen dat met deze behandelingen. Autoclaaf 1,5 mm buitendiameter (OD) glazen pipetten. Met behulp van een micropipet trekker, trek pipetten met een diameter geschikt is voor elektrofysiologische opnames, die kunnen variëren op basis van uw trekker, gloeidraad, en pipetten. 10 De boring is niet te kritisch, omdat de tip zal voorafgaand worden gebroken tot cel collectie. Zorgvuldig bewaren van de pipetten in een stofvrije omgeving waar de tips blijft intact (idealiter gebruik maken van een micropipet opslag pot). Het doorbreken van de tip in een gecontroleerde wijze, houdt een kimwipe strak tussen je vingers in de ene hand en heel voorzichtig de punt van de pipet kwast over het papier 1 tot 2 keer. De opening moet ongeveer 75-100% van de doelgroep celgrootte worden. Pas deze stap totdat u het gewenste resultaat. 3. Voorbereiden van Cultuur, Buizen, en Microscoop Bereid gewenste aantal van 1,7 ml Eppendorf buizen. Voeg 2 ul van PBS, eerste deel buffer als het materiaal wordt gebruikt voor enkele cel aanvullingen, of een andere oplossing voor de opslag van het geoogste materiaal. Voor de oogst, moet u een lichtmicroscoop met een 40x objectief uitgerust met een micromanipulator. Gebruik een pipet houder met flexibele slang toonaangevende weg van de houder. Bevestig de slang op een stabiele ondergrond om ongewenste beweging van de pipet te voorkomen tijdens het verzamelen. Aan het uiteinde van de slang, steek een naald, zodat een 1 ml spuit met een Luer-Lock aansluiting kan worden bevestigd en aan te passen tussen de gebruikers. Als u dekglaasjes, werken met een dekglaasje tegelijk. Indien nodig, breng een dekglaasje aan een nieuwe 35 mm * schotel met PBS of media naar keuze. Hoe langer de cellen worden uit de incubator, de meer ongezonde zullen ze worden en hoe meer hun mRNA profielen zullen afwijken van die van een gezonde cel. Het is van cruciaal belang voor de gezondheid van de cellen aan de andere kant dekglaasjes te bewaren door ze in de couveuse wanneer het niet met hen te werken. Werken zo snel mogelijk met cellen buiten de couveuse. * Met onze opstelling is het noodzakelijk om het gebruik van de deksel van een 35 mm schaal, omdat de wanden van de huidige schotel zijn te hoog om een ​​goede vooruitgang van de micropipet toe naar de coverslip. 4. Oogsten van cellen Zet de micropipet in de micropipet houder. Bevestig micropipet houder aan het invoegen op de micromanipulators. Stel het 40x objectief. Zet de schaal op de microscoop podium en vind een regio van cellen die geschikt zijn voor de oogst. In het geval van primaire neuronale culturen, moet de cel relatief geïsoleerd worden van zijn buren tot de oogst van de omliggende cellen en / of processen te voorkomen. De bevolking van mRNA transcripten tussen de soma en processen verschillen, dus als geïnteresseerd in somatische mRNA's alleen, zorg moeten worden genomen om besmetting van de soma met processen te voorkomen. Plaats de cel die u wenst te oogsten in het centrum van het gezichtsveld. Gebruik de micromanipulator om de micropipet vooruitgang in de richting van de oplossing in de schotel in het licht pad. Laat de pipet tip in de oplossing. Van toepassing zijn positieve druk van dit punt door te blazen licht door de spuit. Kijk door het oculair. De pipet moet verschijnen als een schaduw in het gezichtsveld. Ruim boven het vlak van de cellen, de positie van de pipetpunt totdat het zich binnen het gezichtsveld en richten zich op de pipetpunt met behulp van de grove focus knoppen. Op dit punt moet worden nagegaan of de boring grootte van de pipet is te groot of te klein. De praktijk oogsten zal bieden de mogelijkheid om te bepalen of de juiste maat boring is bereikt op dit punt. Nu, vooraf de pipet in de richting van het vlak van de cellen. Het is belangrijk dat de tip niet te haastig geavanceerd, waardoor het te breken in de regio van waaruit u wenst te verzamelen. Om dit te voorkomen, gebruikt u de grove focus naar het brandvlak tevoren voor het bevorderen van de pipet de punt naar de cellen met behulp van de micromanipulators. Wanneer u dicht bij de cellen, gebruikt u de fijne focus tot zowel de cellen en de pipetpunt in focus. Stop met het toepassen van positieve druk voordat je bij het vliegtuig van de cellen om te voorkomen dat blazen ze af van het dekglaasje. Gebruik de micromanipulators om de pipetpunt zo te plaatsen dat het aanraken van de cel soma u wenst te oogsten. Met behulp van de spuit, zachtjes zuigen via de mond, totdat de cel komt in de pipetpunt. Als de cel is niet het invoeren van de pipet voorzichtig bewegen de tip dichter bij de cel en naar beneden totdat het liften van het dekglaasje. 5. Het opslaan van de Cel Gebruik de micromanipulator om, zodra de pipet omhoog en uit de oplossing. Haal de pipet uit de houder. Houd de 1,7 ml Eppendorf buis in de ene hand en zachtjes breken de punt van de pipet aan de kant van de buis naar de bodem. (Richt op de 0,1 ml markering.) Met de gebroken tip midden in de buis, steek een naald bevestigd aan een 1-3 mL injectiespuit in de bovenste opening van de pipet. Snel op de zuiger waardoor de oplossing in de pipet uit te spuiten in de buis. De cel moet blijven in het uiterste puntje van de pipet en dit moet voldoende zijn om goed te verdrijven de cel. Wees voorzichtig dat u de tip touch aan andere vloeistoffen op de zijkanten van de buis als capillaire werking zal de vloeistof terug te brengen in de pipet. Snel spin down de inhoud van de buis met behulp van een desktop-microcentrifuge en onmiddellijk te bevriezen (bewaren bij -80 ° C) of plaats op ijs voor verdere verwerking (bij voorkeur). 6. ARNA Versterking Ronde 1 Eerste streng cDNA synthese: Maak mRNA / cDNA hybriden. Voor elke 5 pi van enkele cel collectie volume, voeg 1x van het volgende toe aan de collectie buis (op ijs). De reactie kan worden opgeschaald voor grotere collectie volumes (2x voor 10 pi collectie volumes, etc.). Maak een Master Mix door vermenigvuldiging van de volgende reagentia door het aantal collectie buizen plus 10-20% om rekening te houden pipetteren fout. Doe dit voor elke volgende reactie in het ARNA ampification procedure. ON ICE 1,2 pi dNTP's (2,5 mM elk) 2,4 pi 5x Eerste deel buffer 0,3 pi T7-oligo (dT) primer (100 ng / ul) 1,2 pi DTT (100 mM) Breng het volume tot 10.25 ui met nuclease gratis water. Pipet mix en spin kort met behulp van een microcentrifuge. Incubeer gedurende 5 minuten bij 70 ° C naar elke secundaire structuur van het mRNA denatureren. Direct plaats op ijs gedurende minstens 5 minuten. Voeg (weer met behulp van een master mix): 0,3 pi RNasin (40 U / ul) 0,45 pi Superscript III (200 U / pi) 1 ui nuclease gratis water Pipet mix en spin kort. Incubeer gedurende 1 uur bij 42 ° C. Incubeer bij 70 ° C gedurende 15 minuten om de Superscript inactiveren. Verder met de volgende stap. Ronde 1 Tweede streng cDNA-synthese Maak een RNA-primers van het mRNA gedeelte van het mRNA / DNA hybride om te helpen bij de synthese of dubbelstrengs cDNA. ON ICE Om de 12 pi eerste onderdeel reactie, toe te voegen: 8 pi nuclease gratis water 7,5 pi 5x Tweede deel buffer 0,75 pi dNTP mix (2,5 mM elk) 0,25 pi DNA ligase (10 U / pi) 1 ui DNA polymerase I (10 U / pl) 0,25 pi RNase H (2 U / pl) Meng goed door pipetteren en spin kort. Incubeer 2 uur bij 16 ° C. Toe te voegen: 1 ui T4 DNA-polymerase (5 U / pl). Meng door pipetteren en spin kort. Incubeer 10 minuten bij 16 ° C. Het schoonmaken van de reactie met behulp van de Qiagen MinElute kit volgens de aanwijzingen van de fabrikant met lichte wijzigingen: 11 Was twee keer met 500 pL wasbuffer in plaats van een keer met 750 pi. Elueren in nuclease vrij water. Concentreer met 2-4 uL met behulp van een Speedvac of door ethanol neerslag. Voor de ethanol precipitatie, het glycogeen fungeert als een nucleïnezuur drager en wordt gebruikt bij het neerslaan van kleine hoeveelheden DNA of RNA. Het natrium uit het natriumacetaat helpt neutraliseren van de negatieve lading van het DNA backbone, hulp in de neerslag. Het is niet nodig om een ​​master mix van routine neerslag te maken. Voeg 29 uL DEPC water 2 pl glycogeen (5mg/ml) 1 / 10 volume (3 pi) 3M Natriumacetaat 2,5 volumes (~ 250 pi) koud 100% ethanol Meng goed. Neerslag bij -80 ° C (30 min.. Tot O / N). Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was het pellet met 800 pl 70% ethanol. Zorg ervoor dat u volledig of los de pellet door pipetteren of vortexen om te helpen bij het verwijderen van overtollig zout. Centrifuge voor nog eens 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en de lucht drogen gedurende 15-20 minuten. Resuspendeer in 4 pL nuclease vrij water. Bewaar bij -20 of -80 ° C of verder met de volgende stap. Ronde 1 In vitro transcriptie (IVT): Synthetiseren antisense-RNA van de T7 promoter opgenomen in het dubbelstrengs cDNA. Deze reactie wordt uitgevoerd met behulp van de Ambion MEGAscript T7 kit volgens de instructies van de fabrikant, behalve schaal van een 10 pi in plaats van een 20 pi reactie. 12 Het is noodzakelijk om deze reactie monteren bij kamertemperatuur en om de buffer te houden bij kamertemperatuur tijdens de montage. De meegeleverde buffer zal neerslaan het DNA als het ijskoud. Houd de NTP's en enzym mix op ijs wanneer niet in gebruik. AT KAMERTEMPERATUUR Overdracht de geresuspendeerde dubbelstrengs cDNA om een ​​dunwandige PCR-buis. Voeg 4 pi NTP mix (18.75 mM elk) 1 pi 10x reactiebuffer 1 ui 10x enzyme mix Incubeer 14 uur bij 37 ° C in een thermocycler (bij voorkeur) of incubator. Deze reactie kan worden schoongemaakt met behulp van twee verschillende methoden, gevolgd door de concentratie van het monster met behulp van een Speedvac of ethanol neerslag. Voor het opruimen met behulp van een kit, ga dan naar methode A. Voor schoon te maken met een standaard fenol / chloroform extractie, ga dan naar methode B. Methode A: Het schoonmaken van de reactie met behulp van de Ambion Megaclear kit volgens de aanwijzingen van de fabrikant met een aantal wijzigingen 13: Was 2 maal met 500 pL wasbuffer in plaats van een keer met 750 pi. Voor de elutie stap, voeg 50 ul van nuclease vrij water naar het centrum van de kolom, incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Spin bij 10.000 g gedurende 1 minuut. Herhalen in een nieuwe buis. Combineer eluaten. Concentreer monster met 2-4 uL met behulp van een Speedvac OR door ethanolprecipitatie. Voor ethanol neerslag: ammonium acetaat wordt gebruikt in plaats van natriumacetaat in dit geval, omdat het efficiënt in het voorkomen van co-precipitatie van de vrije nucleotiden met het nucleïnezuur. Dit is van belang vanwege de hoge concentratie van NTP's gebruikt in de IVT reactie, die kan remmen stroomafwaarts reacties. Voeg 50 uL DEPC water 2 pl glycogeen (20 mg / ml) 0,6 volumes (37,2 pi) 5M Ammoniumacetaat 2,5 volumes (~ 180 pi) koud ethanol Neerslag bij -80 ° C (30 min.. Tot O / N) .* Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was het pellet met 800 pl 70% ethanol (in nuclease gratis water). Zorg ervoor dat u volledig los de pellet om alle overtollige zout te verwijderen. Centrifuge voor nog eens 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en de lucht drogen 15-20 minuten. Resuspendeer pellet in 4 pi nuclease gratis water. Methode B: Als alternatief kan de ARNA gereinigd worden met een standaard fenol / chloroform extractie. Voeg 50 uL DEPC water 2 pl glycogeen (20 mg / ml) 0,6 volumes (37,2 pi)5M Ammoniumacetaat Een volume (98 pi) fenol: chloroform: isoamylalcohol 25:24:1 (evenwicht van de pH 7,8-8,0) Vortex gedurende 15 seconden. Centrifugeer gedurende 1,5 minuten op half maximale snelheid in een tafelblad microcentrifuge. Breng de bovenste waterlaag naar een nieuwe buis met 2,5 volumes (245 pi) van koude ethanol. Neerslag bij -80 ° C (30 min.. Tot O / N). Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en was pellet met 800 pl 70% ethanol (in nuclease gratis water). Zorg ervoor dat u volledig los de pellet om alle overtollige zout te verwijderen. Centrifuge voor nog eens 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en de lucht drogen 15-20 minuten. Resuspendeer pellet in 4 pi nuclease gratis water. * Het monster kan bevriezen bij deze temperatuur 's nachts tijdens de incubatie. Het is aangetoond dat dit ook daadwerkelijk kan opleveren van nucleïnezuren te verhogen. Ronde 2 Eerste streng cDNA-synthese ON ICE Voeg 1 ui Random primers (0,05 mg / ml) * Verwarmen bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Direct plaats op ijs gedurende minstens 5 minuten. Voeg 2 pl 5x Eerste deel buffer 1 pi DTT (100 mM) 0,5 pi dNTP's (2,5 mM elk) 0,5 pi RNasin (40 U / ul) 1 pi Superscript III (200 U / pi) Meng goed door pipetteren en spin kort. Laat op kamertemperatuur komen gedurende 10 minuten. Deze stap is nodig om uitbreiding van de korte willekeurige primers mogelijk te maken vóór de reverse transcriptie reactie wordt uitgevoerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij 42 ° C. Verhit 5 minuten bij 95 ° C om het RNA denatureren in DNA / RNA hybriden. Plaats op ijs gedurende minstens 5 minuten. Bewaren bij -20 ° C of -80 ° C of onmiddellijk verder met de volgende stap. * De concentratie van willekeurige primers is belangrijk. Als de concentratie te hoog is, zal het product meer afgekapt met elke ronde van versterking. Ronde 2 Tweede streng cDNA-synthese ON ICE Voeg 2 ul T7-oligo (dT) primer (10 ng / pi) * Warmte gedurende 5 minuten op 70 ° C. Direct plaats op ijs gedurende minstens 5 minuten. Spin kort. Voeg 43,5 ul nuclease gratis water 15 pi 5x Tweede deel buffer 1,5 pi dNTP mix (2,5 mM elk) 2 pl DNA polymerase I (10 U / pl) Meng goed door pipetteren en spin kort. Incubeer 2 uur bij 16 ° C. Voeg 2 pl T4 DNA-polymerase (5 U / pl) Meng goed door pipetteren en spin kort. Incubeer 10 minuten bij 16 ° C. Het schoonmaken van de reactie met behulp van de Qiagen Minelute kit als in hoofdstuk 6.2.3. Concentreer met 2-4 uL met een Speedvac of ethanol precipitatie als in de artikelen 6.2.4 tot 6.2.8. * Let op de verschillende voorraad concentratie van T7-oligo (dT) primer in vergelijking met de eerste ronde seconden streng cDNA synthese. Ronde 2 In vitro transcriptie Uit te voeren zoals in paragraaf 6.3. Herhaal de artikelen 6,4 tot 6,6 gewenste aantal keren. Merk op dat elke volgende ronde van de versterking resulteert in een kortere ARNA producten. Het aantal rondes van versterking moet worden beperkt om deze reden. Normaal gesproken, twee tot drie rondes van versterking zijn voldoende om materiaal geoogst van een enkele cel tot microarray analyse uit te voeren te versterken. In het geval van microarray analyse, is de derde ronde IVT reactie uitgevoerd met de Illumina TotalPrep RNA amplificatie Kit volgens de instructies van de fabrikant. Deze procedure bevat biotine-gelabeld UTP in de ARNA dat vervolgens wordt gebruikt voor detectie op een microarray chip. Meet de concentratie van de derde ronde ARNA met behulp van een Nanodrop of Agilent Bioanalyzer met een Nano RNA kit. 7. Representatieve resultaten Succesvolle oogst van een enkele cel van de primaire neuronale culturen kan worden voltooid in minder dan 2 minuten, afhankelijk van de geschiktheid (zie figuur 1). Echter, de tijd voor de oogst varieert tussen systemen en met tussenliggende experimentele manipulatie. Het onderwerpen van de cel naar de ARNA procedure (zie de figuren 4A en 4B) resulteert in microgram hoeveelheden van het totaal versterkt Arna en produceert een karakteristieke brede piek bij geanalyseerd met een bioanalyzer (zie figuur 3). Drie ronden kan worden voltooid in een minimum van drie dagen, waardoor een snelle analyse van enkele cel genexpressie. Figuur 1. Afgebeeld is een voorbeeld van een succesvolle oogst van een geïsoleerde neuron. We selected een relatief lage dichtheid regio (A) en geavanceerde pipetpunt in de richting van de gewenste cel (B). De derde afbeelding (C) toont het gezichtsveld nadat de cel was geoogst. Merk op dat de omliggende processen blijven op het dekglaasje. Figuur 2. Getoond worden twee beelden van pipetpunten, die een ongeschikte maat voor effectieve oogsten. Deze tips zullen leiden tot onvolledige oogst (A) en de oogst van omringende milieu (B) respectievelijk. Figuur 3. Na de oogst en de versterking, analyse met behulp van een bioanalyzer wordt aanbevolen om de verspreiding en de hoeveelheid geamplificeerd RNA te onderzoeken. Een succesvolle versterking van eencellige materiaal zal opleveren totale bedragen die in de lage microgram en zal een distributie die is glad en breed hebben. Figuren 4. Schema van de eerste ronde (A) en de tweede ronde (B) van de ARNA procedure worden weergegeven.