Transcriptome تحليل خلايا مفردة
Summary
نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.
Abstract
كثير من تقنيات تحليل الجينات التعبير تعتمد على المواد المعزولة من السكان غير متجانسة من الخلايا من أنسجة أو خلايا الخليط في الثقافة. 1،2،3 في حالة من الدماغ ، مثل مناطق قرن آمون تحتوي على ترتيبات معقدة لأنواع مختلفة من الخلايا ، ولكل منها ملامح متميزة مرنا. القدرة على حصاد الخلايا واحد يسمح لمزيد من العمق في التحقيق في الخلافات بين الدول وداخلها الجزيئية السكان الخلية. نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة لحصاد الخلايا لمزيد من المعالجة. وتستخدم ماصات غالبا ما تستخدم في عزل الكهربية (باستخدام الطموح) خلية من الاهتمام ودائع مريح هو داخل أنبوب إيبندورف لمزيد من المعالجة مع أي عدد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. يمكن تعديل البروتوكول لدينا محصول من التشعبات من الثقافة الخلية أو الخلايا الفردية حتى من شرائح حادة.
نحن أيضا وصف أسلوب التضخيم آرنا كتطبيق في اتجاه مجرى النهر الرئيسي للالعزلة خلية واحدة. وقد تم تطوير هذا الأسلوب من قبل مختبرنا كبديل لغيرها من تقنيات تحليل الجينات التعبير مثل النسخ والخلف أو في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). 4،5،6،7،8 هذا الأسلوب يوفر لتضخيم خطية من مذيل بعديد الأدينيلات RNA مع بداية femtograms فقط من المواد ونتج عن ذلك مبالغ ميكروغرام من الحمض النووي الريبي العقاقير. المادة تضخيم خطي يقدم تقدير أكثر دقة من التضخيم PCR الأسي من الوفرة النسبية للعناصر transcriptome للخلية معزولة. الإجراء الأساسي يتكون من مجموعتين من التضخيم. لفترة وجيزة ، تأسست فيها بوليميريز RNA T7 موقع مروج [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل في ضعف النصوص التي تم إنشاؤها من مرنا. تتم بعد ذلك بين عشية وضحاها في النسخ المختبر (IVT) التي تفاعل البلمرة T7 RNA تنتج العديد من النصوص العقاقير من [كدنا] مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل. الجولة الثانية تكرر هذه العملية ولكن مع بعض الاختلافات الفنية منذ البداية هي مادة الحمض النووي الريبي العقاقير. ذلك هو المعيار لتكرار الجولة الثانية ، مما أدى في ثلاث جولات من التضخيم. في كثير من الأحيان ، يتم تنفيذ الجولة الثالثة في رد فعل المختبر باستخدام النسخ triphosphates نوكليوزيد biotinylated بحيث يمكن تهجين الحمض النووي الريبي العقاقير المنتجة والكشف على ميكروأري. 7،8
Protocol
Discussion
ملاحظات وأخطاء
- قد ترغب في اتخاذها قبل وبعد عرض الصور التي تم عزل الخلايا المستهدفة والتي تم يمسها في غبش المتبقية.
- إذا كان حل الكثير من يدخل ماصة كما كنت الحصاد ، يمكنك استخدام طريقة 3 Luer لوك التجهيزات والمكبس للحقنة لاجراء الضغط الايجابي في الأنابيب. فإن حجم المطلوب تختلف مع نوع من المعالجة ولكن ما يصل إلى 5 ميكرولتر ينبغي أن يكون على ما يرام بالنسبة لمعظم التطبيقات.
نصائح عامة حول التقنيات البيولوجية الجزيئية
- دوامة جميع أنابيب الأسهم وتدور عليهم قبل إضافة إلى رد الفعل. NEVER الانزيمات الدوامة.
- ردود الفعل مزيج دقيق قبل إضافة انزيم لضمان أن المخزن هو في التركيز السليم.
- الانزيم في الحفاظ على مخزون -20 درجة مئوية إذا كان ذلك ممكنا باستخدام stratacooler. خلاف ذلك ، وإزالة الحق قبل الاستخدام ، والحفاظ على الجليد ، والعودة فورا إلى -20 درجة مئوية.
- يمزج دائما الرئيسي عند إعداد أكثر من رد فعل للحد من الأخطاء pipetting. حساب حجم المطلوبة استنادا إلى عدد من العينات وتضيف 10-20 ٪.
- تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية إلى تأخير التدهور. الحمض النووي الريبي هو الأكثر استقرارا المخزنة في المخزن المؤقت لapurination تؤخر من الحمض النووي الريبي الذي يحدث في الظروف الحمضية.
عام الخطوط العريضة للإجراءات آرنا
ويوضح الشكل 4A الجولة الأولى من الإجراء آرنا. في رد فعل حبلا الأول ، الجزء بولي – T من التمهيدي (DT) T7 – بنسبة ضئيلة لتحديد الأنواع مرنا (مستطيل أبيض طويل) ملزمة لذيول polyA. ومذيل بعديد الأدينيلات أيضا بعض microRNAs وسوف يتم القبض على هذا الإجراء. الأهم من ذلك ، ومع ذلك ، فإن الرناوات الأكثر وفرة في الخلية ، الرنا الريباسي ، لا. هذه جزئية بمثابة التمهيدي للالناسخ العكسي لتجميع حبلا التكميلية لل[كدنا] (الطويل المستطيل الرمادي) باستخدام مرنا كقالب. الجزء التمهيدي من T7 (DT) T7 – جزئية تتضمن بوليميريز RNA T7 المروج في الإطار مع العقاقير تسلسل مرنا للانطلاق. ويستخدم هذا لاحقا في رد فعل في المختبر النسخ.
المقبل ، ومرنا في مرنا الهجين / الحمض النووي التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة محملئا جزئيا H ريبونوكلياز خلق الحمض النووي الريبي "الاشعال" (مستطيلات صغيرة بيضاء) مشابهة إلى شظايا أوكازاكي إنشاؤها في متخلفة حبلا توليف الحمض النووي. البلمرة DNA الأول يستخدم لتجميع شظايا الحمض النووي الريبي DNA الوزراء باستخدام الحمض النووي مكملة لمرنا كقالب. عندما تصل إلى تفتيت الحمض النووي الريبي المقبل ، في 5 'إلى 3' nuclease النشاط يزيل ribonucleotides واستبدالها deoxyribonucleotides. يضاف إلى الحمض النووي يغاز ligate أي فروع فيها استبدال حبلا الرائدة ليست كاملة. يضاف T4 البلمرة DNA لملء في المناطق التي كانت بمثابة شظايا الحمض النووي الريبي الاشعال الأولية لالبلمرة DNA أنا خلق كليلة العضوية المزدوجة [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل التي تتم تنقيته ثم قبل تنفيذ رد فعل IVT.
في رد فعل IVT ، T7 بوليميريز RNA بربط المروج T7 دمجها المزدوج تقطعت بهم السبل [كدنا] ويجمع جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير (مستطيلات سوداء طويلة) باستخدام حبلا الشعور كقالب. هذا بمثابة خطوة التضخيم التي تنتج الآلاف من جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير من كل جزيء الذين تقطعت بهم السبل المزدوج [كدنا] (الشكل 4A).
الجولة الثانية ، كما هو مبين في الشكل 4B ، ويبدأ مع رد فعل عكس النسخ التي تختلف قليلا عن تلك الجولة الاولى منذ البداية هي العقاقير RNA (مستطيل أسود خالص) ، ويفتقر إلى ذيل مذيل بعديد الأدينيلات أنه كان مستهدفا من قبل T7 – بنسبة ضئيلة (DT) التمهيدي في الجولة الاولى. لذلك ، وتستعد هذا التفاعل مع الاشعال العشوائي (مستطيلات صغيرة رمادية) والحمض النووي الريبي التشويه والتحريف لاحقا. وتستعد ثم رد فعل من جانب الشق الثاني التمهيدي (DT) T7 – بنسبة ضئيلة ، والذي يربط تسلسل بولي في نهاية A – 3 'من الحمض النووي الريبي الشعور إنشاؤها في رد فعل عكس النسخ السابقة. يتم تنفيذ رد فعل آخر IVT بنفس الطريقة كما في الجولة الاولى. وعادة ما يتم تكرار هذه الجولة الثانية على الأقل مرة واحدة لتحقيق ثلاثة جولات من التضخيم من خلية واحدة.
تطبيقات
يمكن ترجمتها التقنيات التي قدمناها في هذه المقالة إلى عدد كبير من التطبيقات. يمكن تعديل بروتوكول العزلة خلية واحدة لاستخدامها في شرائح حادة. 14 على الرغم من أن أكثر تحديا من الناحية التقنية ، وتطبق المبادئ نفسها في إعداد هذا البديل. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تعديلها بشكل طفيف في حجم ماصة ، يمكن إجراء تسجيلات لعلم وظائف الأعضاء من الخلايا قبل الحصاد السماح بإجراء تحقيق جيدا للسيطرة الآليات الجزيئية وراء مخرجات الفسيولوجية. آخر تعديل طفيف هو عزل العمليات سوما من الخلية. 15 لهذا التطبيق ، وجمع الهيئات خلية واحدة ماصة ثم نعود مع ماصة الطازجة وجمع 100-300 dendrit المحددةوفاق أو المحاور في أنبوب جمع (16).
بمجرد أن يتم حصاد الخلايا ، ويمكن إجراء مقارنات بين تركيزات مرنا وبين مختلف مكونات وحتى داخل نفس الخلية السكان. دمج biotinylated – UTP آرنا في الجولة الثالثة يسمح للتحليل [ميكروأري لتحديد هذه الكميات المتوفرة مرنا نسبيا. يمكن أيضا أن التركيبة السكانية الأصلية مرنا يتحدد بعد العملية آرنا باستخدام التسلسل التالي جيل. يمكن أيضا أن تستخدم آرنا تضخيم لتأكيد دراسات الخلايا تحويل النمط الظاهري الذي يتم transfected مجموعة كاملة من mRNAs من نوع خلية واحدة إلى نوع من الخلايا المختلفة من أجل إحداث الانتقال من النمط الظاهري من النوع الأخير إلى أن الخلية من السابق ، الإجراء الذي وضعه مختبر والمعروف TIPeR (17). هذه الدراسات مفيدة بشكل خاص لدراسة الحالات المرضية والظواهر الخلية ومثل هذه الدراسات ما زالت جارية في الوقت الراهن في المختبر. لا يمكن أن يؤديها RT – PCR أو qPCR على المواد تضخيم لتأكيد تعبير عن خلية محددة الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تقييمات لكفاءة ترنسفكأيشن أو تنبيغ على مستوى خلية واحدة.
المزايا والقصور
كما جاء في الملخص ، والعزلة واحدة من الخلايا لتحليل يلغي الآثار المشاهدة في المتوسط مع تحليل للسكان الخلية غير المتجانسة. هذه الآثار متوسط تركيزات تحريف مرنا داخل خلية واحدة أكثر من النصوص التي تمثل في المتوسط وفيرة والخروج ومنع الكشف عن محاضر منخفضة وفرة كثيرة. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي لفرز الخلايا الفردية ، ولكن هذا الأسلوب يتطلب معرفة علامات معينة الخلايا ومعدات باهظة الثمن. microdissection التقاط 18 ليزر الأشعة فوق البنفسجية سواء مع أو الأشعة تحت الحمراء نظم الليزر microdissection التقاط تسمح للخلية واحدة ، وحتى التقاط التحت خلوية ولكنها تتطلب الخلايا التي تهم أن يكون موجودا على سطح المقاطع رقيقة جدا (19). مماثلة لالتدفق الخلوي ، ليزر microdissection التقاط كما يتطلب معدات باهظة الثمن.
واحدة من الفوائد الرئيسية لتقنية جمع الكهربائي القائمة المذكورة أعلاه هو أنه يمكن الحصول على بيانات قيمة الكهربية من خلية من الفائدة قبل الحصاد ، مما يسمح للتحليل وظيفي وtranscriptome التي يتعين القيام بها في الخلية نفسها. 20 A السلبي للتقنية لدينا أنها لا تتطلب خبرة في استخدام micromanipulators. سوف المحققون على دراية micromanipulators تجد هذه التقنية بديهية جدا ، ولكن مع عدم وجود أفراد هذه التجربة سوف تحتاج لتصبح مريحة مع الحركات الدقيقة المطلوبة.
المتأصلة في أي أسلوب التضخيم هو تضخيم التفضيلية لبعض النصوص على أساس حجم وتكوين النوكليوتيدات. 4،6،7 تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التقنيات التي تعتمد مثل عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT – PCR) والتضخيم السريع ل[كدنا] تاريخ (العرق) نتيجة التضخيم في الأسي النصوص ، في حين أن تضخيم النتائج آرنا الإجراء في تضخيم الخطية. وهكذا ، واحدة من أهم مزايا هذا الإجراء آرنا يكمن في قدرتها على الحفاظ على أفضل وفرة نسبية من النصوص التي كتبها مرنا فقط تضخيم خطيا أي أخطاء أو التحيزات التي تحدث في عملية التضخيم في مقابل تضخيم الأخطاء بشكل كبير وقال والتحيز.
الإجراء آرنا مقرونا تحليل ميكروأري يسمح للمقارنة بين تركيزات مرنا بين الخلايا واحد من التشكل مماثلة أو مختلفة ، معالجة أو غير معالجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقديم مواد تضخيم لتسلسل الجيل القادم. 5،8 ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر في مثل هذه التحليلات لأنه ، في المقابل الى استخدام بادئات عشوائية لإجراء العملية ، الإجراء بنسبة ضئيلة من DT معبي المذكورة أعلاه التضخيم من التحيزات "3 نهايات مرنا والنتائج عموما في تقصير طفيف في المواد اللاحقة تتضخم مع كل جولة. وينبغي توخي الحذر في تحليل النتائج ميكروأري مع الأساليب القياسية كما تغيب بعض المكالمات كاذبة يمكن أن تنشأ عن تقصير بعض الشيء المادي تضخيمها. بالإضافة إلى ذلك ، في حين تتابع نتائج ستوفر بالفعل 5 كامل قد 'تسلسل معظم مرنا الأصلي ، 5' ينبغي تفويتها تسلسل بعض مرنا. لهذه الأسباب ، ينبغي أن يقتصر عدد جولات من التكبير.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أشكر لك Miyashiro كيفن لطلاء والحفاظ على الثقافات الخلية ، للدكتور تيري Schochet لتوفير الثقافات خلية للصور المدرجة في هذه الوثيقة. بالإضافة إلى ذلك ، أشكر لك Miyashiro كيفن ، والدكتور بيتر باكلي ، وPertiz تينا للحصول على مدخلات بشأن الإجراء آرنا. تم تمويل هذا العمل من المعهد الوطني للشيخوخة ، والمعهد الوطني للصحة النفسية والباحث عن الحقيقة الأموال الموارد البشرية من رابطة ولاية بنسلفانيا.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
| Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
| Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
| Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
| Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
| Boric acid | Sigma | B0252 | ||
| MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
| D-glucose | Sigma | G8769 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
| 1ml syringe | BD | 309628 | ||
| Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
| dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
| dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
| Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
| DTT | Supplied with second strand buffer | |||
| E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
| DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
| Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
| Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
| Random primers | BMB | 11034731001 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
| MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
| T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
| Rnasin | Promega | N251B | ||
| Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
| Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
| Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |
Referenzen
- Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury. Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).
- Eberwine, J. Single-cell molecular biology. Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).
- Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity. The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).
- Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. Single neurons as experimental systems in molecular biology. Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).
- Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders. Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).
- Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications. Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).
- Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).
- Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration. Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126, 397-425 (1977).
- . . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2010).
- . . MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).
- . . Megascript kit. , 7-8 .
- . . MEGAclear kit. , 4-5 .
- Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. mRNA expression analysis of tissue sections and single cells. The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).
- Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).
- Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).
- Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q). Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).
- Vandewoestyne, M., Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. Int J Legal Med. 124, (2010).
- Eberwine, J., Bartfai, T. Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy. Pharmacol. Ther. , (2010).
