El análisis del transcriptoma de células individuales

1. Cultivo de células Nuestro laboratorio utiliza cultivos primarios de neuronas de hipocampo de rata para los experimentos siguientes. A continuación se describe el protocolo modificado para Banker forma en que estos cultivos celulares se crean y mantienen. 9 Existen, por supuesto, una serie exhaustiva de las permutaciones de estas técnicas de cultivo celular y cualquier otro método establecido adaptados a las necesidades específicas de un laboratorio particular que ofrece una suministro constante de células sanas sería un sustituto adecuado. Cinco autoclave, redondo, 12 mm cubreobjetos se colocan en un plato de 35 mm y recubierto con 80 mg / ml de poli-D-lisina (MW 70-150,000) en tampón de borato S / N, enjuagarse con agua (grado de cultivo celular), entonces recubiertas con 1 mg / ml laminina en tampón de borato S / N, entonces enjuagarse de nuevo con agua. NG medios de comunicación (MEM con sales de Earle y Glutamax suplementado con glucosa (0,6% w / v), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / mL), suero de caballo (10% v / v)) y se cocina se almacenan en una incubadora (5% de CO 2 a 37 ° C). El PDL150/laminin sirve como sustrato para las neuronas aisladas de crecer en una monocapa. Los cubreobjetos se puede recubrir hasta dos semanas antes de enchapado. En el día de la siembra, las neuronas primarias de embrión de rata hipocampo día 18 se sembraron en los medios de comunicación NG mediante la adición de 1,5 ml de 100.000 células / ml de suspensión. Cuatro a seis horas después de la siembra, cada plato de 35 mm se trata con 0,75 l de 5 mM citosina beta-D-arabinofuranoside (ara-C) para prevenir el crecimiento de las células gliales contaminantes. Veinticuatro horas más tarde, los medios de recubrimiento se cambia al MEM con sales de Earle y L-glutamina suplementado con un 0,6% w / v de glucosa, 1 mM piruvato de sodio, y B27. Las células se les permite cultivar por lo menos dos semanas antes de su uso en cualquier experimento para permitir el desarrollo completo de los procesos. 2. Pipetas Preparación Nota sobre RNasas: La piel, la saliva, e incluso la respiración son las principales fuentes de RNasas, enzimas que degradan el ARN. Es imperativo que RNasa libre de la técnica se observa desde este punto en el protocolo para que la muestra no se contamine con RNasas y degradar posteriormente. Esto incluye usar siempre guantes para manipular las muestras y reactivos, no hablar más de las muestras o reactivos, y el uso de las nuevas cajas de puntas de las pipetas y tubos esterilizados. A menudo, las pipetas que no están destinados exclusivamente para el trabajo de ARN se descontaminan pasándoles un trapo con una solución de tratamiento RNasa como RNasa AWAY (Bioproducts Molecular). Sin embargo, estas soluciones se inhiben las reacciones enzimáticas aguas abajo por lo que también es importante para evitar la contaminación de las muestras con estos tratamientos. Autoclave de 1,5 mm de diámetro exterior (OD) pipetas de vidrio. El uso de un extractor de micropipeta, pipetas para tirar de un diámetro adecuado para los registros electrofisiológicos, que puede variar en función de tirador, el filamento, y pipetas. 10 El tamaño del agujero no es muy crítica, ya que la punta se rompe antes de la recolección de las células. Guarde con cuidado las pipetas en un ambiente libre de polvo, donde las puntas se mantendrá intacto (lo ideal es utilizar un recipiente de almacenamiento micropipeta). Para romper la punta de una manera controlada, celebrar una Kimwipe tirante entre los dedos en una mano y muy suavemente con el cepillo de la punta de la pipeta a través del papel 1 a 2 veces. La apertura debe ser de aproximadamente 75 a 100% del tamaño de la celda de destino. Ajustar este paso hasta conseguir el resultado deseado. 3. Cultura preparación, tubos, y el microscopio Prepare el número deseado de 1,7 ml tubos Eppendorf. Añadir 2 l de PBS, la primera cadena de búfer si el material se va a utilizar para la amplificación de células individuales, o cualquier otra solución para el almacenamiento del material cosechado. Para la cosecha, se necesita un microscopio de luz con un objetivo de 40x equipado con un micromanipulador. Use un soporte de pipeta con un tubo flexible que se aleja del soporte. Colocar el tubo a una superficie estable para evitar movimientos no deseados de la pipeta durante la recolección. Al final de la tubería, inserte una aguja de modo que una jeringa de 1 ml con una conexión Luer-Lock se puede unir y cambiar entre los usuarios. Si se utiliza cubreobjetos, trabajar con un cubreobjetos a la vez. Si es necesario, la transferencia de un cubre solo a un plato nuevo 35 mm * PBS que contiene los medios de comunicación o de elección. Cuanto más tiempo que las células están fuera de la incubadora, más saludable y que se convertirá en el mayor de sus perfiles de ARNm se desviará a la de una célula sana. Es fundamental para preservar la salud de las células en el cubreobjetos otros por mantenerlos en la incubadora cuando no está trabajando con ellos. El trabajo lo más rápido posible con las células fuera de la incubadora. * Con nuestra configuración, es necesario el uso de la tapa de una placa de 35 mm ya que las paredes del plato actual es demasiado alto para permitir el avance adecuado de la micropipeta hacia el coverslip. 4. Las células de cosecha Asegurar la micropipeta en el soporte micropipeta. Ponga micropipeta titular de la inserción en la micromanipuladores. Establecer el objetivo de 40x. Coloque el plato en la platina del microscopio y encontrar una región de células adecuadas para la cosecha. En el caso de los cultivos primarios de neuronas, las células deben estar relativamente aislado de sus vecinos para evitar que la cosecha de las células que rodean y / o procesos. La población de las transcripciones de ARNm entre el soma y los procesos varían, así que si está interesado en somáticas mRNAs exclusivamente, se debe tener cuidado para evitar la contaminación del soma con los procesos. Coloque la celda que desea para la cosecha en el centro del campo de visión. Utilice el micromanipulador para avanzar en la micropipeta hacia la solución en el plato en la trayectoria de la luz. Baje la punta de la pipeta en la solución. Aplique una presión positiva a partir de ahora soplando suavemente a través de la jeringa. Mire por el ocular. La pipeta debe aparecer como una sombra en el campo de visión. Muy por encima del plano de las células, ajustar la posición de la punta de la pipeta, hasta que se encuentra dentro del campo de visión y enfoque en la punta de la pipeta con los mandos de grueso de enfoque. En este punto, se debe valorar si el tamaño del diámetro de la pipeta es demasiado grande o demasiado pequeño. Recolección de la práctica proporcionará la capacidad de determinar si el tamaño del diámetro correcto que se ha logrado en este momento. Ahora, el avance de la pipeta hacia el plano de las células. Es importante que la punta no es demasiado avanzado rápidamente, causando que se rompa en la región desde la que desea recoger. Para evitar esto, utilice el enfoque aproximado para avanzar en el plano focal antes de avanzar hacia la punta de la pipeta las células utilizando el micromanipulador. Cuando usted está cerca de las células, el uso del enfoque fino hasta las células y la punta de la pipeta están en foco. Dejar de aplicar presión positiva antes de llegar al plano de las celdas para evitar que los soplan fuera del cubreobjetos. Utilice el micromanipulador a la posición de la punta de la pipeta de modo que está en contacto con el soma celular que desee a la cosecha. Mediante la jeringa, aplique una suave succión por la boca hasta que la célula entra en la punta de la pipeta. Si la célula no está entrando en la pipeta, mueva suavemente la punta más cercana a la célula y hacia abajo hasta que se levante de la cubreobjetos. 5. Ahorro de la célula Utilice el micromanipulador para pasar de inmediato la pipeta hacia arriba y fuera de la solución. Retire la pipeta del titular. Sostenga el tubo de Eppendorf 1,7 ml en una mano y suavemente romper la punta de la pipeta en el lado del tubo en la parte inferior. (Apunte para la marca de 0,1 ml.) Con la punta rota centrada en el interior del tubo, insertar una aguja a una jeringa de 3.1 ml en la abertura superior de la pipeta. Rápidamente el émbolo pasar la solución de la pipeta para rociar a cabo en el tubo. La célula debe mantenerse en la punta de la pipeta y esto debería ser suficiente para expulsar correctamente el celular. Tenga cuidado de no tocar la punta de cualquier líquido en los lados del tubo como la acción capilar traerá la parte posterior de líquido en la pipeta. Rápidamente girar hacia abajo el contenido del tubo con una microcentrífuga de sobremesa y congelar de inmediato (la tienda a -80 ° C) o el lugar en el hielo para su posterior procesamiento (de preferencia). 6. ARNA amplificación 1 ª ronda capítulo de síntesis cDNA primer lugar: Crear ARNm / híbridos cDNA. Por cada 5 l de volumen único de recogida de células, 1x añadir lo siguiente para el tubo de recogida (con hielo). La reacción puede ser ampliado para los volúmenes de la colección más grande (2 x 10 volúmenes de la colección de l, etc.) Crear una mezcla maestra de multiplicar los siguientes reactivos por el número de tubos de recogida de 10-20% más para tener en cuenta para pipetear error. Haga esto para todas las reacciones posteriores del procedimiento ampification ARNA. EN EL HIELO 1,2 l de dNTP (2,5 mM cada uno) 2,4 l buffer 5x Primer capítulo 0,3 l T7-oligo (dT) primer (100 ng / mL) 1,2 l de TDT (100 mM) Llevar el volumen hasta 10,25 l con agua libre de nucleasa. Mezclar con una pipeta y girar brevemente con una microcentrífuga. Incubar durante 5 minutos a 70 ° C para desnaturalizar cualquier estructura secundaria del ARNm. Colocar inmediatamente en hielo durante al menos 5 minutos. Añadir (de nuevo utilizando una mezcla maestra): 0.3 RNasin l (40 U / l) 0,45 l Superíndice III (200 U / l) 1 l de agua libre de nucleasa Pipeta de mezcla y una breve vuelta. Incubar durante 1 hora a 42 ° C. Se incuba a 70 ° C durante 15 minutos para inactivar el superíndice. Continuar con el siguiente paso. 1 ª ronda capítulo de síntesis cDNA Segundo Crear iniciadores de ARN de la porción del ARNm del ARNm híbrido / ADN para ayudar en la síntesis of cDNA de doble cadena. EN EL HIELO A los 12 l primer capítulo de la reacción, añadir: 8 l de agua libre de nucleasa 7,5 l buffer 5x segundo capítulo 0,75 l de mezcla de dNTP (2,5 mM cada uno) 0,25 l de ADN ligasa (10 U / l) Una ADN polimerasa l I (10 U / l) 0,25 l RNasa H (2 U / l) Mezclar bien con la pipeta y el giro brevemente. Incubar durante 2 horas a 16 ° C. Agregar: 1 l de ADN polimerasa T4 (5 U / l). Mezclar con la pipeta y una breve vuelta. Incubar 10 minutos a 16 ° C. Limpieza de la reacción, mediante el kit Qiagen MinElute según las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones: 11 Lavar dos veces con 500 l de tampón de lavado en lugar de una vez con 750 mL. Eluir con agua libre de nucleasa. Concentrado de 4.2 l con un Speedvac o por precipitación con etanol. Para la precipitación con etanol, el glucógeno actúa como un transportador de ácidos nucleicos y se utiliza cuando se precipitan en pequeñas cantidades de ADN o ARN. El sodio de la acetato de sodio ayuda a neutralizar la carga negativa de la columna vertebral del ADN, ayudando en la precipitación. No es necesario hacer una mezcla maestra de precipitaciones de rutina. Añadir 29 l de agua DEPC 2 l de glucógeno (5mg/mL) 1 / 10 de volumen (3 l) de acetato de sodio 3M 2,5 volúmenes (~ 250 l) con etanol en frío 100% Mezclar bien. Precipitado a -80 ° C (30 min. A S / N). Centrifugar durante 20 minutos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 800 l de etanol al 70%. Asegúrese de desalojar completamente el sedimento, ya sea por pipeteado o agitación para facilitar la eliminación del exceso de sal. Centrifugar durante 20 minutos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y secar al aire durante 15-20 minutos. Resuspender en 4 l de agua libre de nucleasa. Almacenar a -20 o -80 ° C o continuar con el siguiente paso. En la 1 ª ronda de transcripción in vitro (FIV): Sintetizar ARN antisentido del promotor T7 incorporado en el cDNA de doble cadena. Esta reacción se realiza utilizando el Ambion MEGAscript T7 kit según las instrucciones del fabricante, salvo a escala de un l 10 en lugar de una reacción de 20 mL. 12 Es imprescindible para montar esta reacción a temperatura ambiente y mantener el tampón a temperatura ambiente durante el montaje. El buffer se precipita el ADN si es fría como el hielo. Mantenga el PNT y mezcla de enzimas en el hielo cuando no se utiliza. A TEMPERATURA AMBIENTE Transferir el cDNA de doble cadena resuspendido a un tubo de paredes delgadas PCR. Agregar 4 l de mezcla NTP (18,75 mM cada uno) Un buffer de reacción 10x l Una mezcla de l enzima 10x Incubar 14 horas a 37 ° C en un termociclador (preferible) o incubadora. Esta reacción se puede limpiar utilizando dos métodos diferentes, seguida de concentración de la muestra utilizando un Speedvac o precipitación con etanol. Para su limpieza mediante un kit, proceder a A. Método para la limpieza con un estándar de extracción con fenol / cloroformo, pase al método B. Método A: Limpieza de la reacción, mediante el kit de Ambion Megaclear según las instrucciones del fabricante, con cerca de 13 modificaciones: Lavar dos veces con 500 l de tampón de lavado en lugar de una vez con 750 mL. Para la etapa de elución, se añaden 50 l de agua exenta de nucleasas en el centro de la columna, se incuba a 70 ° C durante 10 minutos. Giran a 10.000 g durante 1 min. Repetir en un tubo nuevo. Combine eluidos. Concentrar la muestra a 4.2 l con un Speedvac o por precipitación con etanol. Para la precipitación de etanol: acetato de amonio se utiliza en lugar de acetato de sodio, en este caso porque es eficiente en la prevención de co-precipitación de nucleótidos libres con el ácido nucleico. Esto es importante debido a la alta concentración de NTP se utiliza en la reacción de formación profesional inicial, que puede inhibir las reacciones posteriores. Añadir 50 l de agua DEPC 2 glucógeno l (20 mg / mL) 0,6 volúmenes (37,2 l) acetato de amonio 5M 2,5 volúmenes (~ 180 l) etanol frío Precipitado a -80 ° C (30 min. A S / N) .* Centrifugar durante 20 minutos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 800 l de etanol al 70% (en agua libre de nucleasa). Asegúrese de desalojar completamente la pastilla para eliminar toda la sal en exceso. Centrifugar durante 20 minutos a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y el aire seco durante 15-20 minutos. Resuspender el pellet en 4 l de agua libre de nucleasa. Método B: Por otra parte, el ARNA se puede limpiar con un estándar de extracción con fenol / cloroformo. Añadir 50 l de agua DEPC 2 glucógeno l (20 mg / mL) 0,6 volúmenes (37,2 l)Acetato de amonio 5M Un volumen (98 l) fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25:24:1 (equilibrado a un pH de 7,8 a 8,0) Vortex durante 15 segundos. Centrifugar durante 1,5 minutos a mitad de la velocidad máxima en una microcentrífuga de mesa. La transferencia de la capa acuosa superior a un nuevo tubo que contiene 2,5 volúmenes (245 l) de etanol frío. Precipitado a -80 ° C (30 min. A S / N). Centrifugar durante 20 minutos a 4 ° C. Quitar el sobrenadante y pellet lavado con 800 l de etanol al 70% (en agua libre de nucleasa). Asegúrese de desalojar completamente la pastilla para eliminar toda la sal en exceso. Centrifugar durante 20 minutos a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y el aire seco durante 15-20 minutos. Resuspender el pellet en 4 l de agua libre de nucleasa. * La muestra se puede congelar a esta temperatura durante la incubación durante la noche. Se ha demostrado que en realidad esto puede aumentar el rendimiento de los ácidos nucleicos. Ronda 2 capítulo de síntesis cDNA primer lugar EN EL HIELO Añadir un cebadores aleatorios l (0,05 mg / mL) * Calor a 70 ° C durante 10 minutos. Colocar inmediatamente en hielo durante al menos 5 minutos. Añadir 2 l buffer 5x Primer capítulo Un TDT l (100 mM) 0,5 l de dNTP (2,5 mM cada uno) 0.5 RNasin l (40 U / l) 1 l Superíndice III (200 U / l) Mezclar bien con la pipeta y el giro brevemente. Deje reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Este paso es necesario para permitir la extensión de los cebadores aleatorios poco antes de la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo. Incubar durante 30 minutos a 42 ° C. Calentar 5 minutos a 95 ° C para desnaturalizar el ARN en ADN / ARN híbridos. Coloque sobre hielo durante al menos 5 minutos. Almacenar a -20 ° C o -80 ° C o inmediatamente continuar con el siguiente paso. * La concentración de los cebadores al azar es importante. Si la concentración es demasiado alta, el producto será más truncada con cada ronda de amplificación. Ronda 2 capítulo de síntesis cDNA Segundo EN EL HIELO Añadir 2 l T7-oligo (dT) primer (10 ng / mL) * Fuego durante 5 minutos a 70 ° C. Colocar inmediatamente en hielo durante al menos 5 minutos. Girar brevemente. Añadir 43,5 l de agua libre de nucleasa 15 ul buffer 5x segundo capítulo 1,5 l de mezcla de dNTP (2,5 mM cada uno) 2 ADN polimerasa l I (10 U / l) Mezclar bien con la pipeta y el giro brevemente. Incubar durante 2 horas a 16 ° C. Añadir 2 l de ADN polimerasa T4 (5 U / l) Mezclar bien con la pipeta y el giro brevemente. Incubar 10 minutos a 16 ° C. Limpieza de la reacción, mediante el kit Qiagen MinElute como en la Sección 6.2.3. Concentrado de 4.2 l con un Speedvac o precipitación con etanol como en las secciones 6.2.4 a 6.2.8. * Tenga en cuenta la concentración de las diferentes T7-oligo (dT) primer en comparación con la síntesis de primera ronda de cDNA segundos. Round 2 En la transcripción in vitro Realizar como en la sección 6.3. Repita las secciones 6,4 a 6,6 el número deseado de veces. Tenga en cuenta que cada ronda posterior de los resultados de amplificación de productos más cortos ARNA. El número de rondas de amplificación debe ser limitada por esta razón. Normalmente, dos o tres rondas de amplificación son suficientes para amplificar un producto de cosecha de una sola célula para llevar a cabo análisis de microarrays. En el caso de análisis de microarrays, la reacción de la tercera ronda IVT se realiza mediante el Illumina TotalPrep Kit de amplificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este procedimiento incorpora marcado con biotina UTP en el ARNA que se utiliza para la detección en un chip microarrays. Medir la concentración de Arna tercera ronda con un Nanodrop o Bioanalyzer Agilent con un kit de ARN Nano. 7. Resultados representante El éxito de la cosecha de una sola célula de cultivos primarios de neuronas se puede completar en menos de 2 minutos, dependiendo de la aptitud (ver Figura 1). Sin embargo, el tiempo de cosecha puede variar entre los sistemas y con la intervención de manipulación experimental. Someter a la célula para el procedimiento de Arna (ver figuras 4A y 4B) se traduce en cantidades de microgramos de ARNA total de amplificación y produce un pico ancho característico cuando se analiza con un Bioanalyzer (ver Figura 3). Tres rondas se puede completar en un mínimo de tres días para permitir un rápido análisis de expresión génica de células individuales. Figura 1. Se muestra un ejemplo de una buena cosecha de una neurona aislada. Nos seleDirección Ejecutiva de una región relativamente baja densidad (A) y avanzado de la punta de la pipeta hacia la celda deseada (B). La tercera imagen (C) muestra el campo de visión después de la celda había sido cosechado. Tenga en cuenta que los procesos que rodean permanecen en el cubreobjetos. Figura 2. Se muestran dos imágenes de la punta de la pipeta, que son de un tamaño inadecuado para la recolección de efectivo. Estos consejos le conducen a la cosecha incompleta (A) y la cosecha de alrededor de medio (B), respectivamente. Figura 3. Después de la cosecha y el análisis de amplificación, utilizando un bioanalizador se recomienda examinar la distribución y la cantidad de ARN amplificado. Una ampliación con éxito a partir de material celular solo producirá cantidades totales de los microgramos de baja y tendrá una distribución que es suave y amplia. Las figuras 4. Esquema de la primera ronda (A) y la segunda (B) del procedimiento de ARNA se muestran.